第十四卷 第三期 - 2010年六月四日 PDF
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血紅素蛋白幫助金奈米粒子分散修飾在晶片上: 從穩定製備高密度雙股DNAs進而進行蛋白質/DNA結合之研究
李昱廷,陳淑慧*
國立成功大學理學院化學系教授
 
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許多分析應用上,固定金奈米粒子在基材上是極為重要的,因為它們可以很容易的修飾上硫醇化的分子。而在基材上,穩定且高密度的金奈米粒子能製備出高密度的探針,進而提升檢測的靈敏度。然而,以目前利用聚合物連結劑例如3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)以及3-硫醇基矽丙烷(MPTS)的方式進行金奈米粒子在基材上的修飾,其修飾密度較小且穩定度也不好;並且基材表面需先經過活化產生羥基。在最近的研究中指出吡喀紫質(porphyrin)能藉由porphyrin macrocycl與金原子產生配位結合,進而在金原子表面形成自組裝單層。Macrocyclic porphyrin ligands 也曾被合成去製備相當穩定的金/porphyrin的奈米複合材料,且porphyrin的環狀結構會平行於金奈米粒子表面。存在於索雷譜帶(Soret band)的訊號可藉由改變環狀結構與金奈米粒子表面的距離做調控,這意謂著金奈米粒子與porphyrin之間存在著電子的作用力。在這個研究中,我們證實了血紅素蛋白質(具有porphyrin官能基),可當作穩定金奈米粒子的高效能連結劑。 然而,不同於porphyrins,一個蛋白質因具有多種官能基而會產生多種作用力。
圖 1 以蛋白質在玻璃上修飾金奈米粒子多層(n=4)以及3-氨基丙基三乙氧基矽烷在玻璃上修飾金奈米粒子單層。

為了研究血紅素蛋白質是否能在晶片上穩定形成多層金奈米粒子中扮演特殊的連結劑,首先我們測試數種血紅素蛋白質(肌紅蛋白Myoglobin,血紅蛋白Hemoglobin,細胞血素cytochrome C)以及非血紅素酸性蛋白質 (酪蛋白 β-Casein,牛血清蛋白BSA,乳白蛋白 α-lactalbumin) 和非血紅素鹼性蛋白(溶菌酶lysozyme)。在此比較中,我們也研究3-氨基丙基三甲氧基甲矽烷修飾之表面。如圖1所示,對於所有血紅素蛋白質修飾過之表面,金奈米粒子能被均勻的修飾上去且顯現桃紅色或較深的桃紅色。在經過多層(n≧4)的修飾後,並沒有明顯的聚集現象,這也指出了此研究的所有血紅素蛋白質,對於形成穩定的金奈米多層都能充當良好的連結劑。然而,在非血紅素蛋白修飾之表面,金奈米粒子不只在酪蛋白以及乳白蛋白上的修飾密度非常低,而且在溶菌酶以及牛血清蛋白上修飾後的顏色呈現深藍色,這也表示有聚集現象產生。 溶菌酶是一種強鹼性蛋白質,具有約11的等電點,因此被預期著可藉由與檸檬酸鹽保護的金奈米粒子表面上的負價電子,因靜電吸引作用而成為一個很好的連結劑。然而,我們的觀察顯示了,從帶電荷的蛋白質官能基所引發的強靜電作用力,會導致聚集現象而非穩定的狀態。 在經3-氨基丙基三乙氧基矽烷官能化的基材上,金奈米粒子塗覆的密度就像非血紅素蛋白質一樣低。為了測試是否血紅素官能基能幫助金奈米粒子的分散性,我們將酪蛋白交叉連結(cross-linked)上血紅素官能基,一個螫合鐵的porphyrin,並且使用這交叉連結上血紅素官能基的酪蛋白當作金奈米粒子的連結劑。在血紅素連結的酪蛋白表面上,金奈米粒子單層或多層的修飾,都能均勻的塗覆上去,就如同在肌紅蛋白一般(圖1),這表示了血紅素官能基對於金奈米粒子的穩定是有所幫助的。 我們也使用掃描式電子顯微鏡來進行單層及多層修飾表面的測試。如圖2a及2b所示,隨著肌紅蛋白從單層逐漸增加到多層,其金奈米粒子修飾密度也漸漸增加,且分散性很好。此外,這些血紅素蛋白質修飾多層,儘管曝露於空氣中超過一個星期,仍保有很好的穩定性。如圖2c所示,金奈米粒子固定於酪蛋白修飾後的表面上,其密度比金奈米粒子固定在肌蛋白表面還低(圖2a),而且也發現到一些局部的聚集現象產生。反之,在血紅素連結之酪蛋白表面上,金奈米粒子修飾單層(圖 2d)及多層,都可得到高密度且好的分散效果,且沒有明顯的聚集現象。這些結果明顯的證明了修飾的蛋白質上的血紅素,在基材上修飾穩定的金奈米粒子複合材,扮演了極為重要的角色。

圖 3. 5/2Au 及 7/2Au 的化學分析電子光譜(a) 肌蛋白-金奈米粒子,(b) 血紅素連結之酪蛋白-金奈米粒子,(c) 酪蛋白-金奈米粒子,以及(d) 3-氨基丙基三乙氧基矽烷官能化-金奈米粒子。
圖 2. 掃瞄式電子顯微鏡及照片影像(a) 以肌蛋白在玻璃上修飾金奈米粒子單層, (b) 以肌蛋白在玻璃上修飾金奈米粒子多層 (n=4), (c) 以酪蛋白在玻璃上修飾金奈米粒子單層,以及(d) 以血紅素連結之酪蛋白在玻璃上修飾金奈米粒子單層。
化學分析電子儀也被使用來研究金奈米粒子與血紅素蛋白質之間的分子作用力。如圖3所示,金奈米粒子以含血紅素或無血紅素的分子固定時,其5/2Au以及7/2Au能帶皆能在不同的金奈米粒子表面被偵測到。對於以血紅素蛋白質,肌紅蛋白,以及血紅素結合之酪蛋白固定之金奈米粒子,可明確地在兩個不同的能帶(5/2Au 以及 7/2Au)各別找出兩個化學態;然而,以非血紅素分子,3-氨基丙基三乙氧基矽烷以及酪蛋白修飾之金奈米粒子,其兩個不同的能帶只存在單一的化學態。顯然地, 利用血紅素官能基結合到酪蛋白,可使得金奈米粒子產生另一個化學態。這些結果顯示了所產生的另一個化學態是與血紅素官能基有關。因為所產生的另一個化學態,其結合能是較低於原本的元素態,而金具有較低的氧化態,像是π軌域作用力,是有可能為了減少週圍分子的穿隧阻力而產生。 另一方面,為了探討金奈米粒子與分子間可能的π配位結合,可以路易斯鹼原子(像是蛋白質上的氮或氧)的化學分析光譜來做測試。藉由比較胺基酸的N1s 光譜圖,我們發現酪蛋白在N1s含有多個氮原子的化學態,其中包含ε-amino 官能基 400eV及N-terminus 官能基399eV。 另一方面,我們觀測到一個401eV的能量峰,並且推測它是由金奈米粒子及外露的血紅素官能基作用所產生。綜合上述結果,我們提出此分散穩定的能力是來自於金奈米粒子與血紅素官能基之間的π結合力。我們也提出此結合力必定是藉由蛋白質的結構改變,促使血紅素官能基外露出來,再經蛋白質上的其它官能基與金奈米粒子作用,使得血紅素結構與金奈米粒子形成面對面的極短距離所致。(如圖表 1右邊所示).
圖表 1. 以血紅素蛋白質,經由金奈米粒子與血紅素官能基之間的π結合作用力,而製備出穩定且多層的金奈米粒子,並運用在同位置進行雜合作用誘導螢光恢復機制,製備高密度的雙股DNA探針,以此進行轉錄因子的結合感測實驗。

接著我們使用肌蛋白修飾的穩定金奈米粒子多層去接上雙股去核醣核酸(dsDNA),其序列包含了雌激素反應元素(ERE),並在同位置以雜和誘導螢光恢復之方式確認雙股DNA的形成(如圖表 1左邊所示)。雌激素反應元素是雌激素接受器的cis調控序列,而雌激素接受器則位於目標基因的促進部位,當雌激素反應元素與雌激素接受器結合時,將會是引發轉錄活化作用的關鍵。 DNA 探針是經由修飾在一端的硫醇基而接到金奈米粒子單層上,而探針的另一端則修飾螢光染料(Cy3)。當互補DNA在晶片上進行雜合,則螢光訊號會隨之恢復, 但只加入保存溶液或非互補DNA時,則無螢光訊號產生(如圖表 1左邊所示)。

兩種細胞株,乳癌細胞(MCF-7)以及肺癌細胞(A549),是常見具有兩種不同雌激素接受器異構物(ERα和β) 的細胞,在此做為研究對象。乳癌細胞一般表現出ER α的含量大於ER β;而肺癌細胞則表現出大量的ER β但極少量的ER α。當兩種細胞都加入17-alpha-雌二醇並反應二十四小時,將可使活化後的ER α及β接到晶片上的雌激素反應元素,並利用酵素免疫法(ELISA)進行檢測。利用與控制組、標準品(人工合成ERα) 的偵測訊號比較,如預期的,乳癌細胞確實被偵測到含ER α的量大於ER β,而肺癌細胞則偵測到較多ER β但非常少量的ER α。這些結果都證實了,以血紅素蛋白質修飾多層金奈米粒子,所整合研發出來的雌激素反應元素晶片,是適合進行定量分析,且具有很好的靈敏度及專一性。
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