第十三卷 第九期 - 2010年五月七日 PDF
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雙功能型氧化釓/碳奈米殼應用於磁振造影與近紅外光熱治療
黃志嘉1、蘇家豪2、李偉銘1、劉子瑜1葉晨聖*1
  1. 成功大學化學系
  2. 高雄長庚紀念醫院 生物醫學轉譯研究中心
 
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了達到早期診斷與治療的目的,將奈米材料應用於顯影與局部腫瘤熱治療已成為熱門研究,其原因是由於材料小尺寸的特性,奈米材料作為顯影劑可達到高空間辨識度,應用於熱治療上,更可避免對周圍健康器官造成額外的熱傷害。因此,如何將奈米材料製作成具有同步診療功能將是未來診療材料應用於生醫奈米之一大挑戰。 本研究承接過去發表成果(Chem. Mater. 2008, 20, 3840–3848),利用生物性質的明膠分子做為模板(直徑約384 nm),製作出氧化釓/碳奈米殼,並應用於小鼠MRI顯影與癌細胞光熱治療(示意圖一)。示意圖一簡述氧化釓/碳奈米殼的製作方式:將準備好的明膠模板/無機釓複合物,經過兩階段熱處理(440 ˚C 空氣環境作鍛燒,接著以600 ˚C氮氣環境作退火處理)即可得到得到結晶性之氧化釓/碳奈米殼。
示意圖 1. 氧化釓/碳奈米殼合成、MRI顯影與光熱治療應用。

圖 1. (a) 氧化釓/碳奈米殼之SEM照片。 (b) 部同溫度熱處理之氧化釓/碳奈米殼XRD 圖譜分析。(c)氧化釓/碳奈米殼 之拉曼光譜圖分析。(d) MTT 檢驗氧化釓/碳奈米殼與氧化釓/碳奈米殼@PSMA對A549 癌細胞毒性分析。
圖1a為氧化釓/碳奈米材料的SEM照片,由SEM測得的3-D影像說明氧化釓/碳的形狀為圓球結構~ 138 nm,超過150個顆粒的尺寸計算,估計氧化釓/碳奈米殼的大小約 138 nm與殼厚約19.2 nm。圖1b之XRD鑑定指出氧化釓/碳的結晶性再經過600 ˚C氮氣環境的退火(anneal)處理後,具有良好結晶性,符合正方晶系氧化釓的繞射峰。為了更進一步確定600 ˚C氮氣環境處理後得到具有碳結構,圖1c利用拉曼(Raman)光譜對氧化釓/碳做分析,由拉曼圖明顯可看出兩根與碳有關的拉曼吸收,分別為G band:~1340 cm-1和D band:~1570 cm-1,位於~1340 cm-1的G峰是與碳規則的sp2石墨層結構有關,後者~1570 cm-1出現的D峰則可能是由非規則排列(disordered)的sp2石墨層,或是sp3結構的碳結構所貢獻。

經過PSMA表面親水性改植後,形成氧化釓/碳@PSMA(氧化釓/碳奈米殼表面覆蓋PSMA高分子) 奈米殼在水中有良好分散性(照片圖插入於圖1c)。以人類肺癌細胞株A549細胞對氧化釓/碳@PSMA奈米殼作細胞毒性分析,實驗方法是選用不同劑量的氧化釓/碳@PSMA奈米殼(濃度範圍為0~500 μg/mL),分析方法採用MTT試劑作細胞存活率檢驗。圖1d實驗結果指出,氧化釓/碳@PSMA奈米殼與細胞培養在劑量500 μg/mL時,細胞存活率仍高達90.4 %,與氧化釓/碳奈米殼相比(細胞存活率76.2 %於材料劑量 500 μg/mL),經過PSMA處理後的氧化釓/碳奈米殼對A549細胞有較佳的生物相容性,推測可能原因是氧化釓/碳@PSMA奈米殼表面有較佳的親水性質。

將石墨碳結構的氧化釓/碳與氧化釓/碳@PSMA奈米殼作體外(in vitro) MRI顯影能力測試(3 T磁場),樣品以釓離子濃度作量測單位,氧化釓/碳奈米殼的r1與r2值分別為10.3 s-1 mM-1與11.0 s-1 mM-1(r2/r1 =1.1),而氧化釓/碳@PSMA奈米殼的r1與r2值分別為14.0 s-1 mM-1與26.2 s-1 mM-1(r2/r1 =1.9)。報導指出將數值以r2/r1作處理後的結果以1.5作分界,若r2/r1數值相當接近於1,代表可作為T1影像的正型顯影材料,若是r2/r1值大於1.5,則會加強T2--weight影像,則為負型顯影材料,根據我們的實驗結果,氧化釓/碳奈米殼可作為正顯影劑,而氧化釓/碳@PSMA奈米殼則作為負顯影材料。
圖 2. (a)小鼠施打氧化釓/碳奈米殼之T1加權影像,觀測時間0-2小時(黑色與白色箭頭分別指出腎臟與肝臟位置)。 (b) 脾臟與肝臟在圖a中影像之訊號變化量。小鼠施打氧化釓/碳@PSMA奈米殼之(c)T2與(d) T2*加權影像,觀測時間0-2小時(白色箭頭指出腎臟位置)。(e) 肝臟在圖(c)和(d)中影像之訊號變化量。

將氧化釓/碳與氧化釓/碳@PSMA奈米殼以頸靜脈注射的方式注射BALB/c小鼠體內,樣品的劑量大為3 mg/Kg(小鼠重),以3 T磁場下的MRI系統作觀察。當注射氧化釓/碳奈米殼後,圖2a可明顯看到腎器官的影像(白箭頭)與注射前相比,2小時後腎影像的擷取有較亮的對比,肝臟位置為黑箭頭處,圖2b指出肝(10%)與腎(16 %)的訊號變化量都有明顯地增加。圖2c與2d利用T2與T2*觀察氧化釓/碳@PSMA奈米殼注射小鼠後的MRI影像,肝組織的影像(白箭頭處)有明顯變暗的成像訊號,尤其以T2*影像最為明顯,隨著體循環的時間增加(0-2小時),影像對比逐漸加強。圖2e數據指出在注入材料1小時後,以T2模式觀察肝臟影像訊號變化量有36%,而T2*影像變化量為15%。根據MRI小鼠的動物實驗結果,我們可觀察到,使用氧化釓/碳奈米殼可做肝與腎影像的追蹤(對比變亮),而氧化釓/碳@PSMA奈米殼使得小鼠的肝影像變暗,因此前者可視為T1型MRI顯影試劑,而後者可往T2型MRI顯影劑發展。

根據小鼠體內注射氧化釓/碳與氧化釓/碳@PSMA奈米殼的組織分佈實驗指出(小鼠重3 mg/Kg;0.5-24小時之循環周期;以ICP-AES分析各個器官內釓離子的殘留量),無論是氧化釓/碳或氧化釓/碳@PSMA奈米殼,在心臟與腎臟中(0.5-24小時),沒有偵測到顯著的釓元素殘留。相較之下,研究發現肝臟、脾臟與肺中的釓元素含量顯得高許多,隨著體循環的時間增加,累積量至3小時達到最大。經過24小時的體循環後,各個組織間的釓含量明顯地下降,代表注入的奈米殼材料可能逐漸排出小鼠體內。

圖 3. (a) 氧化釓/碳@PSMA奈米殼(500 μg/mL)接上EGFR抗體後對A549癌細胞進行7分鐘光熱治療:雷射光強度 20 W/cm2 (上圖), 15 W/cm2 (中圖), and 10 W/cm2 (下圖) 。(b) 雷射光強度對細胞存活率作圖:使用材料為接上抗體後之金奈米棒、二氧化矽@金奈米球、與氧化釓/碳@PSMA奈米殼,樣品對細胞處理濃度固定於500 μg/mL。
根據吸收光譜實驗估計,我們發現氧化釓/碳@PSMA奈米殼具有近紅外吸收特性,莫爾吸收係數於808 nm波長約為ε ~ 1563 M-1cm-1。將氧化釓/碳@PSMA奈米殼先以靜電吸附方式與EGFR抗體作連結,以利奈米殼材料能專一性的辨認A549癌細胞分子(A549具有過度表現EGFR特性)。固定施以500 μg/mL材料劑量對A549細胞預處理,並以808 nm雷射作為光源(七分鐘的照射時間),研究不同雷射功率下材料殺癌細胞的效率,分析方式則是利用calcein AM(綠色螢光)標定活細胞與 EthD-1(紅色螢光)標定死細胞。當以雷射功率10 W/cm2照射A549細胞後,觀察染色後的細胞,發現沒有細胞死亡的訊息,若將實驗使用的雷射功率升高至15 W/cm2,可由圖3-40a觀察到綠色螢光的發光區域中,產生橢圓形黑色區域,對應以EthD-1染劑標定染色照片,出現了橢圓面積的紅色亮點,兩張圖中的黑色與紅色區域位置一致,使用20 W/cm2雷射功率亦得到相同結果。圖3b為不同奈米材料(500 μg/mL)利用光熱轉換殺癌細胞之比較圖(雷射功率對細胞存活率作圖),比較之奈米材料為金奈米棒(長度:40.1 ± 3.4 nm和寬度10.3 ± 1.8 nm)和二氧化矽@金奈米球(直徑: 125.4 ± 13.6 nm 與金殼厚度~12.1 nm),三種材料表面均經過靜電吸附方式接上EGFR抗體,由圖3b圖可看出使用金奈米棒殺癌細胞之雷射光功率需要高於25 W/cm2,而二氧化矽@金奈米球殺癌細胞即使雷射功率升至30 W/cm2,仍無法使癌細胞致死,相較之下使用氧化釓/碳@PSMA奈米殼僅以15 W/cm2即可有效使癌細胞死亡。

本研究利用生物性質的明膠分子做為模板,發展出氧化釓/碳奈米殼材料(球直徑~ 138 nm和殼厚~19.2 nm),並應用於MRI與近紅外光驅動殺癌細胞實驗。體外(in vitro) MRI顯影能力測試結果指出,氧化釓/碳奈米殼具有使影像對比變亮之能力,而氧化釓/碳@PSMA奈米殼則可作為影像對比變暗之負型顯影劑。此外,氧化釓/碳@PSMA奈米殼可吸收近紅外光,並能專一性地與癌細胞結合,經由近紅外光照射後可殺癌細胞,與金奈米棒和二氧化矽@金奈米球兩材料相比,氧化釓/碳@PSMA奈米殼可用較低雷射光功率殺死癌細胞。
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