第十二卷 第四期 - 2010年一月十五日 PDF
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新型免疫晶片在快速病毒檢測之應用
楊松益1、連剛逸2、黃國珍3、黎煥耀3李國賓1,*
1國立成功大學 工程科學系所
2奈米科技曁微系統工程研究所
3微生物與免疫學研究所
 
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研究提出一種整合型微流體生醫晶片可達到快速自動化疾病檢測功能。利用微機電技術整合多個微元件於微流體晶片中,其用包含微幫浦、微混合器、微閥門及微管道,可完成樣品傳輸混合、純化分離、聚焦偵測及分選功能。首先在磁珠表面接上特定的鍵結抗體,專一性的鍵結抗體只會與特定病毒鍵結,最後再與專一性的螢光抗體鍵結,形成一三明治免疫分析法,經螢光分析儀可在晶片上測得螢光抗體的螢光值。實驗結果可得到最小病毒偵測極限為103 PFU/mL,全程操作時間不超過40分鐘。本研究晶片之體積甚小,具有可攜式的優點,且晶片製作成本低廉,相當適合臨床上快速檢測。

近年來,由於在生物學研究中單株抗體技術及螢光染料的發展,結合了細胞培養方法的先進技術,使流式細胞儀技術(Flow cytometry)的發展達到了巔峰,現今流式細胞儀技術已深入到藥物學、生物學、基因體學及臨床醫學等研究領域。儘管流式細胞儀在生物應用上有非常高的靈敏度及準確性,但其儀器非常昂貴、需專業人員才能操作及需較多的生物樣品量…等缺點,讓傳統流式細胞儀無法普遍、快速及大量的應用在病源菌檢測。近年來,有許多文獻提出用高順磁性磁珠,可快速純化及處理包含DNA、細胞及病源菌等生物檢體。其優勢有,(一)三維空間的微珠表面積增加可讓更多的抗體及抗原鍵結在表面,大大提高偵測的靈敏度;(二) 生物分子可容易固定在微珠表面,提高鍵結效率,達到生物樣品快速前處理及偵測;(三)將不同的鍵結抗體接於微珠表面,可用於同時偵測多種不同病毒,提高病源菌檢測的多元性。

圖1所示,為整合型免疫磁珠晶片病毒檢測流程示意圖。6μm 大小的超順磁性磁珠表面接有特異性鍵結抗體,在微混合器的作用下,可快速與目標病毒鍵結(圖1(a));隨後一高強度的磁場將表面接有病毒的抗體磁珠吸附在晶片底部,再通入乾淨的清洗液將多餘的病毒清洗掉(圖1(b));接者加入螢光抗體,再與表面接有病毒的抗體磁珠在微混合器中混合,螢光抗體會快速鍵結在病毒上(圖1(c));當高強度磁場靠近時,可將磁珠綜合體(磁珠表面已分別接上鍵結抗體、病毒及螢光抗體)吸附在晶片底部,隨後通入清洗液將多餘的螢光抗體清洗乾靜(圖1(d));接者經由兩邊鞘流的流體聚焦方式,可將樣品流中流動的磁珠綜合體依序一顆一顆流過光學偵測區,螢光抗體上所接的螢光物質會被特定雷射光所激發,螢光訊號可以被光電倍增管(Photo multiplier tube, PMT)所接收(圖1(e));當有螢光訊號時,控制器會即時讓微分選閥門進行開關切換,可將所需的磁珠綜合體收集到特定的分選槽中(圖1(f))。
圖1 整合型免疫磁珠晶片病毒檢測流程示意圖。

圖2(a)所示為整合型免疫磁珠晶片,包含生物樣品反應模組、微流式細胞術模組及光學偵測模組三大部份。樣品反應模組是由一個微混合器、兩個試劑槽、一個癈液槽、三個微幫浦及二個微閥門所組成,其中兩個試劑槽分別用來填裝螢光抗體及清洗液。新型的薄膜式微混合器由兩個半圓形的二具甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)薄膜、兩半圓形氣壓腔體及一圓形樣品反應槽所組成,半圓形的薄膜半徑為3500μm,厚度為200μm。當氣壓分別進入左右兩邊的半圓形氣壓腔體時,兩半圓形的PDMS薄膜可以上下運度,可讓反應槽內的磁珠左右反覆移動,其透過電磁閥的頻率控制可以使氣壓產生一脈衝式的氣源,讓抗體磁珠可以在圓形反應槽中快速達到鍵結效果。
圖2 整合型免疫磁珠晶片示意圖。

免疫磁珠晶片是由二片PDMS層及一片玻璃層組成,最上層稱作流道層,包含數個微管道、儲存槽及一個反應槽,中間層稱作氣壓腔體層,包含數個微幫浦、微閥門及一個微混合器。首先在矽晶片上利用微機電技術,形成SU-8光組的圖形元件,稱之為母模,隨後利用鑄造及塗佈技術形成PDMS元件層,最後將二片PDMS層與玻璃層,利用氧電漿設備進行表面改質後完成封裝流程,圖3(a)所示,為免疫晶片實體圖。圖3(b-1)秀出薄膜式微混合器、微幫浦;圖3(b-2)微流道的母模實體圖;圖3(b-3)微分選閥門的母模實體圖;圖3(b-4)所示,為微流體聚焦管道母模實體圖,其聚焦管道截面尺寸是寬250μm x 高100μm。光學偵測模組是由一個光電倍增管、一個半導體電射、兩個光學濾波片、兩組光學聚焦鏡片、一個分光鏡及一個光學攝影機(Charge coupled device, CCD)所組成。圖3(c)所示,為螢光分析儀實體圖,其整體尺寸是長400mm x 寬260mm x 高500mm。
圖3 (a)整合型免疫磁珠晶片實體圖; (b)微元件母模實體圖; (c) 螢光分析儀實體圖。

圖4(a)所示為微幫浦微幫浦流速與驅動頻率關係圖,藉由單一電磁閥之控制及輸入高壓空氣之下,可使薄膜結構產生順序下壓之動作,而產生驅動微流體樣本沿微流道前進之推力。由實驗結果顯示當微幫浦之頻率增加時,微流體的流速呈現上升之狀態,其最佳操作條件為當操作頻率為30 Hz,通入之高壓空氣氣壓為30 psi時,此微流體幫浦可達到210 µl/min的流體流速。

微混合器最主要的功能是用來提高生物樣品及磁珠抗體的鍵結效率。圖4(b)所示為混合器對病毒、螢光抗體及抗體磁珠的混合效率圖。首先,一濃度為107 PFU/mL及液體體積為100μL的第二型登革熱病毒,與磁珠表面接有抗登革熱E型的鍵結抗體(液體體積10μL及抗體磁珠濃度103 beads/mL),被置入圓形反應槽內進行混合反應,數分鐘後使用磷酸緩衝溶液(Phosphate buffered saline, PBS)進行病毒清洗動作,隨後再加入2μL抗prM的螢光抗體,與接有病毒的抗體磁珠進行混合反應、清洗及螢光偵測,微混合器所使用的操作頻率及氣體壓力是2Hz及3psi。兩條主要的曲線分別表示第一階段與第二階段,在不同時間的混合效率,第一階段為登革熱病毒與磁珠抗體在不同時間的混合情況,以及固定螢光抗體混合時間在5分鐘,從第一階段曲線圖中可看出最佳的登革熱病毒與磁珠抗體混合時間是10分鐘。第二階段的曲線為固定革熱病毒與磁珠抗體的混合時間在10分鐘,並改變螢光抗體混合時間,從第二階段曲線可看出最佳的螢光抗體混合時間在5分鐘。
圖4 (a)微幫浦流速與操作頻率關係圖; (b)薄膜式微混合器生物樣品混合效率圖。

圖5(a)所示,為螢光分析儀所測得的磁珠綜合體螢光訊號圖,訊號1、2及3表示不同的病毒濃度所測得螢光訊號,每一個訊號強度表示正好有一顆磁珠綜合體流經過光學偵測區時所測得的訊號值,在基準線以上的訊號才判定為有效值,基準線以上的訊號強度其S/N比都大於17。

圖5(b)所示,為病毒最低極限偵測圖,分別測試了107至102 的病毒濃度,當病毒濃度低於103以下時,就無法測得有效的螢光訊號值。全程操作時間包含病毒的進樣、反應、分離、偵測及分析不超過40分鐘。抗體的專一性對三明治免疫分析法是相對重要,專一性高的抗體可以準確鑑別出特定性的病毒。圖5(c)所示為抗體的專一性測試圖。訊號1及訊號2分別使用第二型登革熱及71型腸病毒與抗體磁珠的鍵結測試,從訊號1的資料中可看出第二型登革熱可以成功的鍵結在高專一性的抗體磁珠上,並被光學偵測器測得螢光訊號,反觀71型腸病毒就無法被高專一性的抗體磁珠鍵結產生螢光訊號。可証明磁珠抗體只會與第二型登革熱鍵結,而不會與其它病毒反應。
圖5 (a)磁珠綜合體螢光偵測訊號圖; (b)病毒最低極限螢光偵測圖; (c)鍵結抗體專一性測試圖。
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