第十卷 第六期 - 2009年九月十一日 PDF
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凝血酶調節素的類凝集素功能區專一性的與路易士Y抗原結合以中和脂多醣誘導的發炎反應
石宗憲1,2、施桂月1,2,*、蕭錫閔1,2、高遠忠1,2、郭冠麟1,2、馬志遠1,2、郭承翔1,2、張碧英1,2、張權發3,4、林俊宏3,4、翁啟惠3,4吳華林1,2,*

1國立成功大學醫學院生化分生所
2國立成功大學心血管研究中心
3中央研究院基因體研究中心
4中央研究院生化學研究所

Blood. 2008 November 1; 112(9): 3661–3670.

 
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血酶調節素 (TM) 是抗凝血系統裡重要的輔因子,為一種廣泛表現的醣蛋白,最先發現存在於血管內皮細胞。我們在此證明重組的凝血酶調節素N端類凝集素功能區片段 (TM第一功能區,rTMD1) 具有治療敗血症的功能。敗血症由革蘭氏陰性菌感染引起,是造成院內病人死亡的主要原因。重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段,以透過干擾CD14與脂多醣結合的方式,有效抑制革蘭氏陰性菌細胞壁成分脂多醣 (LPS) 誘導的發炎物質產生。重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段亦能專一性的與克雷白氏肺炎菌 (Klebsiella pneumoniae) 以及脂多醣上的路易士Y抗原結合。此外,將重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段打入以脂多醣或是革蘭氏陰性菌誘發敗血症小鼠的體中,能降低發炎反應,且增加脂多醣或是革蘭氏陰性菌在血液中的清除率。因此,由於重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段能有效的抵抗細菌感染和抑制脂多醣誘發的發炎反應,我們認為其在治療敗血症中嚴重發炎反應極具價值,特別是針對革蘭氏陰性菌的感染。

圖一: 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段藉由干擾CD14與脂多醣結合以降低發炎物質的產生。(A及B) 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段在加入RAW 264.7之前先與脂多醣混合。混合物加入細胞經過六小時培養,收集培養液測量 (A) 腫瘤壞死因子α 及 (B) 一氧化氮的含量。(C) 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段會阻斷CD14與脂多醣結合。脂多醣先覆蓋在96孔盤,並與CD14及不同濃度的重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段培養。CD14與脂多醣的結合能力以CD14的專一性抗體偵測。
為了測試是否重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段具有抗發炎的特質,我們以酵母菌以及哺乳類蛋白表現系統製備重組的凝血酶調節素功能區片段。在小鼠巨噬細胞RAW 264.7以脂多醣誘導發炎反應的實驗中,我們首次測試重組的凝血酶調節素功能區片段的抗發炎作用。隨著重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段的劑量增加,能有效抑制RAW264.7在脂多醣誘導下腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及一氧化氮 (NO) 的產生 (圖一,A及B)。因此,我們認為重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段與脂多醣結合能阻斷脂多醣與其結合分子,如CD14的結合。如圖一,C所示,隨著重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段劑量增加能有效阻斷CD14與脂多醣結合。

為了測試重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段是否專一性的與革蘭氏陰性菌及脂多醣結合。分別利用重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段與重組的凝血酶調節素功能區片段2及3 (rTMD23) 與克雷白氏肺炎菌、脂多醣、牛血清蛋白進行結合試驗。只有重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段能專一性的與克雷白氏肺炎菌結合 (圖二,A)。因為重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段能與革蘭氏陰性菌結合,因此脂多醣被認為是重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段極具潛力的候選配體。因此測量重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段及重組的凝血酶調節素功能區片段2及3,分別與脂多醣、牛血清蛋白的結合能力。實驗證明只有重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段能專一性的與脂多醣結合 (圖二,B)。為了鑑定脂多醣上對凝血酶調節素類凝集素功能區片段的專一配體,利用AlphaScreen方法測試各種不同碳水化合物與凝血酶調節素類凝集素功能區片段的親和力 (圖二,C)。結果顯示,路易士Y (Ley) 抗原是重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段的專一性配體 (圖二,C)。
圖二: 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段透過與路易士Y抗原的專一交互作用與克雷白氏肺炎菌以及脂多醣結合。(A) 克雷白氏肺炎菌或是牛血清蛋白,(B) 脂多醣 (E. coli O111:B4) 或是牛血清蛋白。(A和B) 克雷白氏肺炎菌、脂多醣、或是牛血清蛋白先覆蓋在96孔盤。加入等莫耳數的重組的凝血酶調節素功能區片段,並偵測其結合能力。(C) AlphaScreen試驗結果,n=4。醣類與重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段的結合專一性以相對強度表示。各個醣類以數字標記。

圖三: 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段減少脂多醣及克雷白氏肺炎菌誘導的發炎反應及致死率。(A及B) 在腹腔注射脂多醣(20 mg/kg) 之前先給予靜脈注射重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段。在注射脂多醣六小時後,收集血清進行以下測試 (A) 腫瘤壞死因子α(B) 一氧化氮的表現量。(C) 小鼠接受脂多醣 (40 mg/kg) 注射後,在下列不同時間點0,6,12,24小時注射四劑重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (2 mg/kg),並觀察存活率,每實驗組小鼠隻數=20。(D及E) 在注射克雷白氏肺炎菌 (5×102 CFU/mouse) 之前先注射重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段,並收集注射克雷白氏肺炎菌12小時後的血清進行以下測試 (D) 腫瘤壞死因子α(E) 一氧化氮的表現量。每實驗組小鼠隻數=10。(F) 在注射克雷白氏肺炎菌 (5×102 CFU/mouse) 之前先給予重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (10 mg/kg),並觀察其存活率,每實驗組小鼠隻數=20。
因為重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段能抑制脂多醣誘導的發炎物質產生,我們推測重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段在體內試驗中,或許可以治療脂多醣誘導的發炎反應、甚至是降低個體的死亡。小鼠以脂多醣 (20 mg/kg) 進行腹腔注射六小時後,腫瘤壞死因子α與一氧化氮大量表現。然而,當小鼠接受重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (1–5 mg/kg, [43.66– 218.3 nmole/kg]靜脈注射能有效的降低腫瘤壞死因子α與一氧化氮的表現量 (圖三,A及B)。為了研究是否上述效果亦能減少致死率,我們對注予脂多醣的小鼠,進行四劑重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (2 mg/kg) 或是生理食鹽水的注射,同時觀察各組小鼠的存活率,直到任何測試組別的小鼠全數死亡為止。重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段在敗血症中可以有效的改善存活率 (在脂多醣注射一天後,重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段組別其存活率為100%;生理食鹽水組別其存活率為10%;脂多醣注射四天後,重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段組別其存活率為60%;生理食鹽水組別其存活率為0%) (圖三,C),因此建議重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段或許具有治療的潛力。為了測試是否重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段對於革蘭氏陰性菌引起的致死也有治療效果,我們以腹腔注射的方式將克雷白氏肺炎菌注入小鼠體內誘發全身性的敗血症,並施以重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段作為治療 (圖三,D-F)。腫瘤壞死因子α及一氧化氮在小鼠接受克雷白氏肺炎菌 (5×102 CFU) 注射後12小時大量增加。然而,重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (5-25 mg/kg; 靜脈注射) 能有效的減少腫瘤壞死因子α及一氧化氮產生 (圖三,D及E)。在存活率實驗中,接受克雷白氏肺炎菌(5×103 CFU) 的小鼠在18小時內全數死亡,然而接受單一劑量靜脈注射重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (10 mg/kg) 的小鼠,在超過24小時後則仍有50%存活率 (圖三,F)。

腹腔注射脂多醣 (20 mg/kg) 小鼠的血液中脂多醣的含量,在兩小時會達到最大值,並以半衰期約6至8小時的速度自血液中逐漸被清除 (圖四,A) 。注射重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段能有效的增加脂多醣的清除 (圖四,A)。為了測試是否重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段降低克雷白氏肺炎菌誘導的致死率也是透過清除血液中的細菌,因此測量血液中的細菌數量。兩組小鼠各 腹腔注射克雷白氏肺炎菌 (5×102 CFU或生理食鹽水) 並加以靜脈注射重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (10 mg/kg)。重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段在注射細菌後的12、24、及36小時,能有效的增加克雷白氏肺炎菌在血液中被清除的效率 (圖四,B)。
圖四: 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段能增加脂多醣類及細菌在體內被清除的效率。(A) 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段對於脂多醣在血流中被清除的影響。以腹腔注射方式將脂多醣 (20 mg/kg)注入小鼠體內,在靜脈注射重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (10 mg/kg) 後的各個時間點收集血清,血液中脂多醣的含量以Limulus amebocyte lysate 試驗來測試。每組時間點,n=5。(B) 重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段增加克雷白氏肺炎菌在血液中的清除率。以腹腔注射方式將克雷白氏肺炎菌(5×102 CFU/mouse)注入小鼠體內,在靜脈注射重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段 (10 mg/kg) 後的各個時間點收集血清並測量細菌的含量,n=5。

總論,重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段與路易士抗原Y的專一性結合,於調控脂多醣誘導的發炎反應中提供了一個嶄新的機制。重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段在治療急性革蘭氏陰性菌敗血症的醫療應用潛力值得被高度注意。而我們鑑定路易士Y作為重組的凝血酶調節素類凝集素功能區片段的專一性配體,提供體內以凝血酶調節素類凝集素功能區片段與路易士Y結合為基礎的生物功能,一個新的研究方向。
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