第七卷 第七期 - 2009年二月二十日
人類第二色胺酸氫氧化酶多型性標誌與台灣漢民族躁鬱症致病機轉之功能性研究
林宜玫1、趙新志2、陳琮明1、賴德仁3、陳嘉興1孫孝芳1,2,*

1成功大學基礎醫學研究所
2成功大學分子醫學研究所
3中山醫學大學精神部
hssun@mail.ncku.edu.tw

Arch Gen Psychiatry. 2007; 64(9):1015-1024

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-血清素(5-hydroxytryptamine or serotonin;簡稱5-HT)是大腦皮質上主要的神經傳導物質之一,能藉由其神經訊息之傳遞參與調控許多生理機能,例如認知功能與情緒之調節。而先前的研究亦已顯示,血清素在躁鬱症的病理成因上應扮演相當重要的角色。人類第二色胺酸氫氧化酶(Tryptophan hydroxylase 2 ;TPH2)是中樞神經系統中負責血清素合成的重要酵素。自2003年此基因首次被發現以來,已經有許多的研究指出TPH2上的多型性標誌與許多的精神疾病(包含躁鬱症)之間有關連性存在,因此證實了它的重要性。然而這些研究都只侷限在統計遺傳學的層次,對於TPH2實際的致病位點及其在人類第二色胺酸氫氧化酶生物功能上的影響卻未被發現及探討。本篇研究即希冀利用遺傳學理論和現代分子生物技術進行功能性分析,來證實此基因在躁鬱症病理成因上所扮演的角色。

台灣漢民族在TPH2基因上之序列變異和躁鬱症之遺傳分析研究-為瞭解TPH2在人類躁鬱症病理成因上的角色,我們利用45位漢民族個體DNA,在此基因的促進子和外顯子區域進行有系統的序列分析,以找出適用於漢民族遺傳分析之序列變異。我們在這些區域中一共發現了十個序列變異位置,包含一個單核酸突變點,而在其餘九個可用以進行遺傳分析之單核酸多型性標誌中(SNP),有兩個為漢民族特有之多型性標誌 (詳見表一)。而進一步使用這些多型性標誌進行遺傳關連性分析以及連鎖不平衡基因定位之結果(圖一)皆指出, TPH2 基因和躁鬱症病理成因之間存在有顯著之統計相關性。
表一  漢民族在人類TPH2基因上之序列變異

a.單核酸多型性標誌在基因體上之位置以轉錄起始點為零之相對鹼基位置標示
b.資料來源:dbSNP 資料庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/; Build 124, 2005)
c.變異點G33775A 僅在一異合子個體DNA中被偵測到,且其對偶基因A之發生頻率小於百分之一,因此被推斷為一突變點。

圖一. 躁鬱症病人和對照組在TPH2基因之五端區域顯現出不一致的連鎖分佈 躁鬱症病人和對照組在TPH2基因五端區域之連鎖分佈情形以Graphical Overview of Linkage Disequilibrium (GOLD) 軟體繪圖表示,參考數值為取絕對值之連鎖不平衡係數(standardized linkage disequilibrium coefficient (D’) )。 紅色代表完全的連鎖分佈 (D’ =±1), 藍色代表沒有連鎖分佈 (D’ = 0). 六個多型性標誌位點依五端至三端之順序排列。 (節錄自 Arch Gen Psych 2007; 64(9):1015-1024)

TPH2基因上的序列變異點在其蛋白質生物功能上造成之改變:儘管遺傳統計分析的結果指出TPH2基因跟躁鬱症之發生有關連性存在,為了更進一步地瞭解這些序列多型性標誌,是否會造成蛋白質生物功能上的改變,並直接影響疾病之發生,本研究選擇了數個可能的多型性標誌進行功能性分析。由於生物資訊預測之結果顯示,位於啟動子上的兩個單核酸多型性變異位點(T-703G 和 T-473A),有可能會影響此序列與腦部特有的轉錄因子POU3F2 (nOCT3)之結合能力,並進一步影響TPH2的表現程度。我們使用了報導基因系統和電泳膠移動分析,證實了當此兩個位點同時改變時,會明顯地降低下游基因(此實驗中以報導基因代表生物體內之TPH2)之表現程度(圖二A),並且兩個位點之單核酸改變,皆會影響與POU3F2之結合能力(圖二B)。而另一個位於編碼區內的單核酸多型性標誌,則明顯會影響TPH2表現蛋白的酵素活性(圖二C; 測量TPH2酵素作用之終產物表現量來代表酵素活性)。綜合以上所述,這些多型性變異位點的確會造成蛋白質功能的改變。結合此功能性分析與先前遺傳統計分析之結果發現,這些會顯著影響蛋白質功能之變異位點,其對疾病發生之個別貢獻並不大,然而同時考量多個位點相互作用後卻對疾病發生有顯著之調控能力。這些結果符合了之前學界對於此種複雜性常見疾病所提出的“常見疾病-常見變異"的假說,也就是這些常見疾病的發生,其實與許多廣泛分佈於族群中的變異有關。

第一及第二色胺酸氫氧化酶之相互作用及其對躁鬱症發生之影響- 在生物體內,同屬相關連生理系統或調節網路之各基因,會彼此相互影響,且其交互作用對體內各樣的平衡和正常生理功能,都扮演極重要的角色。TPH1 和TPH2 同為色胺酸氫氧化酶,雖各有不同的生物功能及重要性,卻共用許多酵素作用所需之因子,是否此二蛋白質是完全獨立調控或會相互影響,在先前的研究中尚未被釐清。本研究證實儘管程度上有差異,兩個酵素在各腦區中的確皆有表現(圖三A)。進一步運用先前針對兩個基因對躁鬱症發生風險的遺傳學資料分析發現,此兩個基因會發生交互作用並進一步改變躁鬱症的發生風險。我們的研究結果發現,當單獨考慮TPH2的一個基因型TAG時,其對躁鬱症提供的風險為3.73倍。然而同時考慮兩個基因的特定基因型組合時,躁鬱症發生之風險比會有明顯的改變,能增加或減少至4.81及1.68倍(圖三B)。這也是第一次有研究證實了這兩個同源基因之間相互作用的存在。
圖二 TPH2基因上各多型性標誌之對偶基因改變可影響啟動子和蛋白質酵素活性 (A) 利用冷光報導基因系統,分析多型性標誌T-703G和T-473A對啟動子活性之調控能力。將帶有T-703G和T-473A四種對偶基因組合之TPH2啟動子序列,建構至冷光報導基因質體之啟動子位置,各質體轉染後表現之冷光值即用以代表其上之啟動子活性。當兩個位點同時改變時(TT→GA),在IMR-32和SH-SY5Y兩種細胞中,報導基因之表現程度皆會明顯地降低(冷光值以平均加減標準差表示)。 (B) 電泳膠移動分析(Electrophoretic mobility shift analysis (EMSA))之結果,也顯示出此兩個多型性標誌之對偶基因改變,皆可降低其與POU3F2的結合能力。 (C) 位於編碼區內的單核酸多型性標誌C2755A,其對偶基因改變會使得蛋白質產物的第41個氨基酸,由絲胺酸(Serine; TPH2_41S)變為酪胺酸(Tyrosine; TPH2_41Y)。為瞭解這樣的氨基酸改變,是否會影響蛋白質功能。我們將可表現這兩種蛋白質之載體轉染至SH-SY5Y細胞,並測量細胞培養液中,此蛋白質酵素作用之終產物(血清素)表現量,來代表TPH2表現蛋白的酵素活性。血清素濃度則是藉由血清素酵素免疫分析法來測量。結果發現帶有TPH2_41Y所產生的血清素濃度較TPH2_41S低了百分之四十左右。可知此對偶基因的改變會明顯地影響酵素活性。

結語- 本研究旨在探討人類第二色胺酸氫氧化酶(Tryptophan hydroxylase 2 ;TPH2)與躁鬱症病理成因的關係。不同於先前研究僅就統計遺傳學的層次,支持TPH2基因與躁鬱症之間的關連性。本研究中應用了遺傳學理論和現代分子生物技術,找出台灣地區漢民族TPH2基因上的所有序列變異點,也發現了數個與躁鬱症的發生有統計相關性的序列變異點,的確會造成第二色胺酸氫氧化酶蛋白質生物功能上的改變。這是頭一次有研究論文證實了改變人類第二色胺酸氫氧化酶生物功能的序列多型性與躁鬱症的病因有關。另一方面,TPH2與第一色胺酸氫氧化酶 (tryptophan hydroxylase; TPH1;主要表現於周邊神經系統)的交互作用現象,亦在本研究中被證實,雖然目前學界相信同屬於一個系統內的各基因間是存在著交互作用現象,但實際的例子則相當有限。本研究不但證實了TPH2TPH1蛋白質在人類大腦的許多區域內皆同時存在,且有不同程度的表現,更進一步利用先前研究TPH1基因與躁鬱症相關性的資料,成功的證明了TPH2TPH1的交互作用的確可以影響躁鬱症發生的風險。這樣的結果也推翻了近幾年學者所提出,TPH1基因主要表現於周邊神經系統,因而不需重視其在中樞神經疾病的影響之看法。自20世紀末以來,遺傳學家們對常見複雜性疾病提出了“常見疾病-常見變異"(common disease-common variant)的假說,也就是這些常見疾病的發生,其實與許多廣泛分佈於族群中的常見序列變異有關。在這個假說之下,每一個變異點或基因對於疾病的貢獻也許並不大,對於疾病的發生也非必要因素。然而,多個變異點或遺傳因子彼此交互作用的綜合影響,卻會導致像躁鬱症此種常見的複雜性疾病發生。綜合而論,本研究為這假說做了強有力的驗證,也必定能對躁鬱症的致病機轉和其治療有一定程度的貢獻。
圖三 第一及第二色胺酸氫氧化酶之間的交互作用會影響躁鬱症的發生風險 (A) 在人類腦區的各部位皆有第一及第二色胺酸氫氧化酶(TPH1, TPH2)的表現 (B)當TPH1和TPH2的特定基因型組合被同時考慮時,躁鬱症發生之風險比會由原先TPH2單獨貢獻之3.73倍,增加或減少至4.81及1.68倍。 (節錄自 Arch Gen Psych 2007; 64(9):1015-1024)
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