第六卷 第十期 - 2008年十二月十二日
利用二甲基同位素標定搭配親和性選擇之策略來純化並分析蛋白質N端
沈柏村、徐睿良、陳淑慧*

國立成功大學理學院化學系
shchen@mail.ncku.edu.tw

Anal. Chem. 79, 9520-9530, 2007

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析蛋白質的N端對於生物學以及方法學具有很大的重要性。在生物學方面,蛋白質N端序列的分析可以提供機會來了解牽涉到蛋白質合成過程的酵素以及修飾,並且有助於了解相關機制。例如:在許多真核生物的蛋白質合成中,蛋白質的起始胺基酸-甲硫胺酸(methionine)會被水解掉並加成一個乙醯基團到新生成的N端胺基酸。膜所包覆的蛋白質或是分泌性蛋白質會在初合成時,其N端會具有一段訊息序列(signal peptide)或稱領導序列(leader peptide),這段訊息序列會引導蛋白質到不同的轉運系統,於是具有這段訊息序列的蛋白質才能夠進入細胞的蛋白分泌途徑,這段訊息序列會在共轉譯(co-translation)過程中被訊息序列酵素(signal peptidase)所切除,而造成新的蛋白質N端。最為人知的例子就是胰島素mRNA通過轉譯可得到前胰島素原蛋白,其前面的23個胺基酸殘基的訊息序列在轉運到高爾基體的過程中被切除。再者,對於細胞內蛋白質更新(protein turnover)的調控,蛋白質N端的切割過程也具有重要性。
   
在方法學方面,在過去有Edman切割法,可以逐步切割胺基酸,直到整個蛋白質氨基酸序列建立起來,但缺點就是時間耗費太多、對於N端有修飾的蛋白質無法進行分析以及必須高純度的樣品才可以使用這個方法。近年來也有一些團隊針對蛋白質N端的分析開發了新的方法,例如:所謂的“定位性蛋白質體(positional proteomics)”,在蛋白質層次進行了乙醯化反應,酵素消化反應後,再針對新生成的內部胜肽的N端進行生物素化(biotinylation),接著再以有卵白素(strepavidin)衍生化的固相與生物素化的內部胜肽反應,而將內部胜肽留在固相上,於是殘留的部份就只剩下蛋白質N端胜肽,這個方法針對了每個蛋白質的N端胜肽進行分析,因為一個蛋白質只有一個N端胜肽,所以鑑定這些胜肽片段就等於鑑定了整個蛋白質體,但由於此方法採用了乙醯化,所以鑑定到乙醯化N端胜肽並不能判斷其為化學修飾或是天然修飾。另外也有利用結合二段式層析的方式(COFRADIC)來分析N端胜肽,其做法同為在蛋白質層次進行了乙醯化反應,不同的是酵素消化反應完成後,先進行了第一次的高效能液相層析的分離,再針對了新生成的內部胜肽的N端進行三硝基苯磺酸(TNBS)的修飾並進行第二次的高效能液相層析的分離,由於三硝基苯磺酸的修飾會使得內部胜肽變得更加疏水,所以在第二次的分離當中N端胜肽會與內部胜肽分離開來,再收集N端胜肽進行分析,此方法也是無法判斷乙醯化N端胜肽為化學修飾或是天然修飾,但這兩個方法如果採用的是氘形式的乙醯化就可以避免這個問題。

整個純化以及分析N端胜肽的策略以流程圖表示於圖一,為了能夠同時對於具有天然修飾或是沒有修飾的N端胜肽進行分析,我們在蛋白質層次先進行二甲基同位素標定,會標定在蛋白質之N-端胺基及離胺酸之ε-胺基,接著進行酵素消化反應,再將產生的蛋白質胜肽片段通過具有醛基衍生化的固相反應物,透過還原胺化反應將內部胜肽留在固相上,所殘留的部份即為蛋白質N端胜肽片段,再進入質譜進行分析。二甲基同位素標定是本實驗室所開發用於定量蛋白質體學分析之化學方法,步驟簡單、產率接近100%,更重要的是其修飾使二次質譜所產生之胜肽N端a1離子碎片具有訊號放大之功能,這是利用質譜鑑定N端胺基酸或其化學修飾最重要之利器,本研究旨在取此二甲基a1離子碎片訊號放大之優勢,來發展蛋白質N-端之質譜鑑定法。我們並將所開發之方法命名為二甲基同位素親和性選擇法(Dimethyl Isotope Coded Affinity Selection, DICAS).
圖一、 二甲基同位素標定搭配親和性選擇來純化並分析蛋白質N端之策略

為了確定整個分析流程,首先我們先以二甲基同位素標定肌紅蛋白(myoglobin)來看看標定效果,肌紅蛋白上面總共有20個標定位置,肌紅蛋白在標定前以電噴灑質譜偵測其電荷分佈圖(圖二A),再經過運算後得到分子量為16974.14 Da(圖二C),標定後其電荷分佈圖(圖二B),再經過運算後得到分子量為17613.21 Da(圖二D),其分子量差距為639.07 Da,而每一個位置標定後會增加32.0564 Da,所以相當於20個標定位置都有標定上去,也就是說在整個蛋白質的標定過程是趨近完全的。

圖二、肌紅蛋白其電荷分佈圖以及質量計算值。電荷分佈圖:標定前為A、標定後為B;質量計算值:標定前為C、標定後為D。

我們接著以三個蛋白質混合物(血紅素、肌紅蛋白、乳清蛋白)來進行整個分析流程,二甲基同位素標定蛋白質後,再經過胰蛋白酶消化後,以醛基衍生化的固相將內部胜肽抓取掉,經過醛基衍生化的固相抓取後,從其選擇離子層析圖可以確定經過固相抓取後,內部胜肽離子強度很明顯地降低了許多,顯示出抓取效果具有一定功效。經過固相抓取後,蛋白質N端已經純化出來,經過質譜分析後,可以得到其二次質譜圖,圖三即為乳清蛋白N端胜肽的二次質譜圖,由於二甲基同位素標定的N端胜肽其斷裂碎片會有很明顯的a1離子的產生,在此二次質譜圖中a1為134.12,由於這個a1離子提供了準確質量值,所以可以用來確定蛋白質N端的種類為麩氨酸(E, glutamic acid),其位置在乳清蛋白的第20號位置,所以如果此時進行MASCOT資料庫比對是找不到這一段N端胜肽,原因在於一般的資料庫含有的蛋白質序列是包含訊息序列的,而蛋白質在訊息序列被切割後已經產生了新的蛋白質N端,所以無法在一般資料庫中鑑定到這一段胜肽,所以我們將一般資料庫整理成可以鑑定到新生成的N端胜肽的特定資料庫,再進行比對就可以鑑定到這一個N端胜肽,所以可以得知乳清蛋白具有1st -19th胺基酸訊息序列(MMSFVSLLLVGILFHATQA)。
圖三 乳清蛋白N端胜肽的二次質譜圖。MASCOT資料庫比對可以鑑定到被切除的N端1-19訊息序列(MMSFVSLLLVGILFHATQA)

在經過標準蛋白質混合物的分析測試後,我們將整個分析策略應用在MCF-7乳癌細胞蛋白的分析上,分析結果顯示出在經過固相抓取後有80%以上純化之胜肽都是蛋白質N端胜肽,在其中有包含了乙醯化修飾、甲酸化以及二甲基同位素標定後的N端胜肽,例如,在MCF-7細胞中所鑑定出的acyl-CoA-binding蛋白,由其N端胜肽的二次質譜圖中b與y離子片段,可以推得出N端為乙醯化並且沒有a1離子的訊號產生,而可以與二甲基同位素標定的修飾有所區別,並且乙醯化是與蛋白質穩定以及活性、調控蛋白質與蛋白質之間的作用力有關的修飾,除此之外,我們亦發現了從未被報導過的Profilin 蛋白N端1st-32th胺基酸訊息序列,推測可能與骨架蛋白之重整有關。所以整個分析策略是可以用來純化並且分析蛋白質N端胜肽,並且可用以探討蛋白質切割(protein processing)的現象。
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