第六卷 第八期 - 2008年十一月二十八日
中樞神經系統修復之策略--阻斷鈣離子調控星狀膠細胞麩胺酸/天門冬胺酸轉運蛋白基因表現
劉于鵬1、楊重熙2曾淑芬1,*

1成功大學生命科學系
2國家衛生研究院奈米醫學研究中心
stzeng@mail.ncku.edu.tw

Journal of Neurochemistry. 2008 Apr;105(1):137-150.

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星狀膠細胞(astrocyte)是中樞神經系統中最重要的膠細胞。在發育或成熟的中樞神經系統,能夠調節神經細胞的分化成熟與代謝、神經傳導物質的恆定,及神經突觸的可塑性。在健康的中樞神經系統中,為了刺激突觸間訊息傳遞,高濃度的麩胺酸(glutamate)被短暫釋放到細胞外,接著麩胺酸立即被神經細胞或是麩胺酸轉運蛋白(glutamate transporters)所回收,以維持正常的生理環境 (圖一)。但是,當突觸間隙累積過多的麩胺酸就會導致神經細胞的傷害,由於離子性麩胺酸受器(ionotropic glutamate receptor)被過度活化而使過多的鈣離子流入神經細胞引起神經興奮性毒性反應(excitotoxicity)。過量的麩胺酸會導致中樞神經系統的傷害,例如脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、癲癇(epilepsy)、局部缺血(ischemia)、創傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury),可能皆與星狀膠細胞膜上的麩胺酸轉運蛋白功能缺陷有關。星狀膠細胞上的麩胺酸轉運蛋白中,以麩胺酸/天門冬胺酸轉運蛋白(glutamate/aspartate transporter, GLAST /EAAT1)與麩胺酸轉運蛋白-1(glutamate transporter-1, GLT-1/EAAT2)最具重要性,可以保護神經元免受過量麩氨酸引起的神經興奮性毒性反應。
圖一、星狀膠細胞上的麩胺酸轉運蛋白 (GLAST 與GLT-1)負責突觸間隙麩胺酸神經傳遞物質的恆定。

鎘(Cadmium)是廣泛利用於顏料與電池的毒性重金屬。也由於食物、水與菸草被檢驗出有鎘的存在,因此易累積於人體中,如:腎、肝、肺、睪丸、骨髓與血液循環系統。近來研究發現,鎘可藉由改變血腦障壁滲透性或經由嗅覺傳遞路徑進入中樞神經系統。鎘進入中樞神經系統後,被認為導致許多神經退化性疾病,如脊髓側索硬化症和阿滋海默症。臨床研究也發現,在鎳-鎘電池工廠中的ALS病人,其血腦障壁受鎘破壞且提高了腦部麩胺酸誘導之興奮性毒性反應。這些文獻報導說明鎘汙染的環境可能會造成星狀膠細胞麩胺酸轉運蛋白功能的喪失。在我們的研究結果顯示,星狀膠細胞培養在內含低於致命劑量的氯化鎘的培養基內,其麩氨酸回收能力減低,而且GLAST基因表現受到抑制。也證實了鎘導致胞外鈣離子大量流入胞內,引發胞內訊息傳遞路徑抑制GLAST基因表現。

結果

鎘促使星狀膠細胞中GLT-1和GLAST表現量的下降。
當處理濃度5,7和10 μM的氯化鎘時,結果發現星狀膠細胞中的麩胺酸回收量下降為百分之30到50 (圖2A)。核酸即時定量分析(Q-PCR)的結果指出GLAST mRNA的表現量在處理氯化鎘24小時後,不同氯化鎘濃度會造成不同程度mRNA表現量的抑制現象(圖2B)。而且,星狀膠細胞中的GLAST mRNA表現量所受到的抑制現象是會隨著氯化鎘處理時間增長而加劇。為了探討另一種麩氨酸轉運蛋白GLT-1在氯化鎘處理的星狀膠細胞內麩胺酸回收現象中所扮演的角色,星狀膠細胞接受一種GLT-1選擇性的抑制劑(DHK)的處理。結果發現處理DHK並不會影響星狀膠細胞麩胺酸的回收作用。而且,處理DHK的星狀膠細胞比起控制組,在氯化鎘導致的麩胺酸回收抑制現象上並沒有顯著的差異。因為細胞內的麩胺酸數量也會受到稱為Xc-系統的胱胺酸(cystine )/麩氨酸交換蛋白所調控,促使L-胱胺酸進入細胞內,伴隨L-麩胺酸排到細胞外空間。因此,為了排除氯化鎘可能調節Xc-系統降低細胞內麩胺酸量的可能性,我們使用Xc-系統的抑制劑LQ處理星狀膠細胞。發現LQ並不會改變氯化鎘降低星狀膠細胞中麩胺酸的回收能力。這些結果證實在氯化鎘處理的星狀膠細胞中,麩胺酸回收率的減低是受到GLAST基因表現量受到抑制的影響。

轉殖人類GLAST基因啟動子(promoter)的質體DNA到星狀膠細胞,再進行基因啟動子活性分析,發現星狀膠細胞中GLAST基因啟動子活性在不同濃度的氯化鎘處理下,都會產生顯著性的下降(圖2C)。是否GLAST mNRA表現量的下降是因為鎘造成星狀膠細胞內的GLAST mRNA不穩定現象? 為了要回答這問題,星狀膠細胞在處理氯化鎘後,在加入轉錄作用的抑制劑actinomycin D。Q-PCR的分析指出,氯化鎘處理組和控制組,GLAST mRNA表現量都會隨著時間下降。但是,和控制組比較,氯化鎘並不會加速星狀膠細胞GLAST mRNA量的下降(圖2D)。這些結果證實氯化鎘處理引起星狀膠細胞GLAST mRNA表現量的下降,是因為GLAST的轉錄受到抑制,而非GLAST mRNA不穩定現象。
圖二、氯化鎘抑制星狀膠細胞麩胺酸回收量與GLAST基因表現。(A).氯化鎘(5 μM,7 μM,10 μM)減低星狀膠細胞麩胺酸的回收量。*p < 0.05;# p < 0.05 (與5 μM CdCl2比較)。(B).氯化鎘導致星狀膠細胞GLAST基因表現下降。星狀膠細胞以不同濃度氯化鎘處理24小時。使用Q-PCR分析GLAST mRNA的表現量。*p < 0.05。(C).星狀膠細胞經由24小時轉殖內含人類GLAST基因啟動子的質體DNA,再暴露在不同濃度氯化鎘下24小時。細胞溶解物以冷光分析進行測試啟動子活性。分析結果以個別的蛋白質濃度標準化。* p < 0.05。(D).星狀膠細胞處理10 μM氯化鎘6小時,接著處理轉錄抑制劑(actinomycin-D)。以Q-PCR分析分析GLAST mRNA的表現量。插圖表示控制組與鎘處理組 GLAST mRNA的衰變速率並沒有差異。

鎘顯著性的增加細胞內鈣離子濃度
文獻報導指出鎘增加蝸牛神經元胞內鈣離子濃度,進而抑制受GABA激活的離子流。為了測試氯化鎘是否透過鈣離子所調控的訊號路徑,來抑制星狀膠細胞內GLAST基因轉錄,我們先觀察是否氯化鎘會影響胞內鈣離子濃度。圖3A的結果顯示,在培養星狀膠細胞的培養基內加入濃度5 μM和10 μM的氯化鎘時,於20秒內胞內鈣離子的濃度顯著性地增加。結果發現當星狀膠細胞前處理細胞內鈣離子螯合劑(chelator)-BAPTA-AM,10 μM的氯化鎘無法增加胞內鈣離子濃度。為了進一步證實氯化鎘所引起的胞內鈣離子濃度增加是因為誘發胞外鈣離子的流入,我們將10 μM的氯化鎘加入不含鈣離子的培養基。如我們預期地,並沒有發現星狀膠細胞內鈣離子濃度的上升(圖3A)。這些結果證實氯化鎘誘發胞外鈣離子流入,造成細胞內鈣離子濃度大量增加。

鈣離子訊號影響星狀膠細胞內麩胺酸的回收和GLAST mRNA的表現
上述的觀察促使我們去探討鈣離子在處理氯化鎘的星狀膠細胞中,影響麩胺酸回收活性的效應,接下來一連串的實驗使用胞外的鈣離子螯合劑(EGTA)和胞內鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)來進行。當星狀膠細胞分別前處理EGTA或BAPTA-AM,能完全地阻斷氯化鎘所誘導的星狀細胞中麩胺酸回收活性的抑制現象(圖3B)。這些觀察說明氯化鎘增加胞內鈣離子,引發細胞內訊息路徑,抑制星狀膠細胞中麩胺酸回收的功能。

為了進一步探討氯化鎘誘導的鈣離子訊號在表現GLAST mRNA上的角色,星狀膠細胞以EGTA和BAPTA-AM處理。前處理EGTA,能夠完全阻止氯化鎘在GLAST mRNA表現上的抑制效應。而且,BAPTA-AM能夠回復星狀膠細胞GLAST的基因表現。而且EGTA或BAPTA-AM能夠顯著地阻止氯化鎘對GLAST基因啟動子活性的抑制效應(圖3C)。利用膠體電泳位移分析我們也發現氯化鎘可以增加轉錄因子AP-1 和CREB 結合到GLAST 基因啟動子上,而且前處理EGTA和BAPTA-AM時,會抑制這兩種轉錄因子對啟動子的結合能力。說明了鈣離子濃度的上升可能活化AP-1/CREB,結合到GLAST基因啟動子,進而進行抑制GLAST基因的轉錄。
圖三、氯化鎘增加胞外鈣離子流入星狀膠細胞內,進而抑制星狀膠細胞GLAST基因表現。 (A). 鈣離子影像分析顯示在星狀膠細胞內鈣離子濃度隨著5 μM與10 μM氯化鎘的給予而增加,但在有10 μM胞內鈣離子螯合物(BAPTA-AM)時,氯化鎘無法增加胞內鈣離子。(B).EGTA與APTA-AM的前處理,阻斷氯化鎘抑制星狀膠細胞GLAST mRNA表現的作用。(C).星狀膠細胞經由二十四小時轉殖含有人類GLAST promoter的質體DNA,再用EGTA 和BAPTA-AM前處理,接著處理10 μM氯化鎘24小時。細胞溶解物以冷光分析進行測試GLAST基因啟動子活性。分析結果以個別的蛋白質濃度標準化。然而,其他跟蛋白激酶抑制劑並不會阻斷氯化鎘抑制星狀膠細胞GLAST基因表現。* p < 0.05。

結語

   經過一系列生化分析,我們認為星狀膠細胞內鈣離子濃度急速上升能引起胞內多重訊息傳遞路徑,造成星狀膠細胞內的GLAST基因表現受到抑制,因而導致星狀膠細胞對回收麩胺酸的活性下降;鈣離子所活化的AP-1/CREB或是未知的抑制性因子可能參與GLAST基因表現的抑制機制。我們的研究提供重要證據闡明,在中樞神經受傷期間,星狀膠細胞內鈣離子濃度的上升可能會導致星狀膠細胞對回收麩胺酸的能力下降,進而增加損傷的中樞神經系統的二次傷害。因此,抑制鈣離子內流入星狀膠細胞以便維持星狀膠細胞回收麩氨酸的能力,可以作為未來中樞神經系統損傷後一個有效的治療策略。
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