第六卷 第一期 - 2008年十月十日
JNK1經由磷酸修飾Sp1以調控Sp1在細胞有絲分裂期的穩定性
洪建中

國立成功大學生物科學與科技學院生物訊息傳遞研究所助理教授
petehung@mail.ncku.edu.tw

Molecular Biology of the Cell, Vol. 19, p. 1139-1151, 2008.

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去幾十年研究指出轉錄因子藉由調控基因的表現而在很多的生物功能中扮演一個重要的角色。一群特定的轉錄因子可以經由不同的組合方式結合到不同基因啟動子上,因此能在相同的時間或空間中個別而準確調控生物體內廣大而複雜的基因正常表現。其中Sp1是一類令我們特別有興趣的轉錄因子,因為它是普遍存在於所有的哺乳細胞中,而且負責調控在細胞週期、自我毒殺機制和細胞分化等的基因的表現,因此Sp1在正常生理反應中是極為重要。

轉錄因子的活性是取決於三個因素:本身轉錄因子的轉錄活性強度、與DNA結合能力和轉錄因子量的多寡。先前研究Sp1轉錄活性大多著重於如何調控它的活性強度和DNA的結合能力。然而,對於蛋白質穩定性是否也是一個可能影響Sp1轉錄活性的重要因素相關的研究是較少人去著手。現今已經有許多報告指出蛋白質後轉譯修飾(Post-translational modification, PTM),包括:類泛素化(sumoylation)、糖化(glycosylation)、泛素化(ubiquitination)、乙烯化(acetylation)與磷酸化 (phosphorylation) 能夠去修飾Sp1蛋白質,進而影響Sp1的轉錄活性強度、與DNA結合能力和蛋白質穩定性。其中磷酸化修飾而調控Sp1的功能是被研究較多,而且先前也有研究指出細胞週期會影響Sp1被磷酸根修飾的程度,例如:當細胞週期進入到DNA合成期(S phase)Sp1會被細胞週期蛋白依賴性激酶2 (cyclin-dependent kinase 2)磷酸化而促進Sp1的轉錄活性並增強Sp1的DNA結合能力。但是Sp1的功能和磷酸化程度在細胞間期以外的時期是較少被探討,例如細胞有絲分裂期(mitotic phase)。因此,本研究將著重探討Sp1在有絲分裂期的磷酸化修飾程度,以及是否有其他磷酸激酶會在此時磷酸化Sp1,還有此時磷酸修飾對Sp1的功能影響,或著甚至這Sp1的影響會對細胞造成和種生理意義的改變。

雖然先前的研究已經指出Sp1在不同的細胞週期會有不一樣的分佈,然而我們也進一步分析發現Sp1在細胞間期是與DNA分布於相同位置而佔滿整個細胞核,但是當細胞進入到有絲分裂期Sp1卻與DNA有完全部一樣的分佈。因此,我們在此呈現在不同細胞週期的Sp1分布與細胞核膜變化(圖1)。在細胞間期染色質和Sp1是一致的分佈在細胞核中。另外,一個標示核膜位置的蛋白質-Laming是也被觀察,並且呈現一個完整的細胞核形狀。當細胞進入到有絲分裂中期時(metaphase)核膜會消失而且染色質是呈現高度壓縮狀態,而Sp1則分布於染色體區域以外的整個細胞中。接著當細胞進入到有絲分裂末期時(telophase)核膜逐漸呈現而且Sp1與染色質也開始分佈於相同區域。如這些結果,Sp1在不同細胞週期是明顯被偵測到,顯示Sp1蛋白質是被完整的保留在有絲分裂期,進一步我們推測Sp1在有絲分裂期是被有效的保護而不被分解,以及Sp1在不同細胞週期會影響它與DNA的結合能力進而可能影響Sp1的分佈。
圖1. Sp1在不同細胞週期的分布。子宮頸癌細胞是用抗Sp1(綠, G–L)抗體和抗lamin A/C(紅, M–R)抗體進行雙重染色 DNA 是用DAPI染色(藍, A–F)

圖2. (A)在子宮頸癌(HeLa)、肺癌(A549)和乳癌(MDA-MB-231)細胞中在有絲分裂期Sp1是被高度磷酸化而造成亮帶的高分子量位移,細胞週期素B(cyclin B)是一個有絲分裂期標示蛋白質,而肌動蛋白(actin) 是當蛋白質量對照組 (B) 有絲分裂期細胞萃取液是被處理去磷酸酶(CIP) 造成Sp1去磷酸化。

我們本篇著重於研究Sp1是如何避免泛素依賴性分解路徑(ubiquitin- dependent degradation pathway)。首先利用利用微管(microtubule)聚解抑制劑-nocodazole處理子宮頸癌(HeLa)、肺癌(A549)和乳癌(MDA-MB-231)等細胞株以同步細胞週期而方便我們個別取得有絲分裂期或是在間期的細胞,細胞週期素B(cyclin B)是一個有絲分裂期標示蛋白質,在西方點墨法分析實驗中發現Sp1在細胞間期會呈現兩條亮帶(band)的訊號,而且以較下面亮帶訊號為主,但是當細胞進入有絲分裂期,這Sp1亮帶訊號會位移至上方為主(圖2 A)。近一步我們進行一個去磷酸酶分析實驗(CIP assay)檢測Sp1亮帶位移至上方是否是因為磷酸化修飾所造成,結果顯示從有絲分裂期所取得的細胞萃取液經過去磷酸酶處理並且在37°C 環境中反應一個小時,Sp1的主要亮帶訊號會從原本的上方位移回到下方(圖2B),因此這結果顯示Sp1在有絲分裂期會被高度磷酸化。

這c-Jun胺基端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)家族中的一員,而且它是一個已知當細胞暴露於紫外光、熱休克或活性氧(ROS)等壓力環境中會被活化起來的激酶。在這個研究我們首先發現在細胞有絲分裂期JNK 1是會被活化而且導致Sp1在此時期的高度磷酸化形成,然而,令人覺得有趣的事是在處理JNK抑制劑(SP600125) 後不只Sp1的磷酸修飾會被抑制而且Sp1的總蛋白質量也會有極顯著的下降現象(圖3A)。這些結果指出在有絲分裂期JNK1高度鄰酸化Sp1可能保護Sp1蛋白質免於進行泛素依賴性路徑而被分解。此外,Sp1也是一個已知在很多癌細胞中是呈現一個高度表現狀態,為了研究在癌化過程中造成Sp1的高度累積現象是否與有絲分裂期JNK1被活化機制有關,因此我們處理nocodazole而收集大鼠神經膠瘤(glioma)細胞和大鼠和正常的初級神經膠細胞(primary glial cells)的間期及有絲分裂期細胞進行實驗分析,結果發現在神經膠瘤細胞中的實驗和之前其它腫瘤細胞株結果一樣在有絲分裂期JNK1會被活化,而且Sp1會被高度磷酸化並維持他的總蛋白質量,但是在初級神經膠細胞中的結果卻發現在有絲分裂期JNK是不被活化,而且Sp1的蛋白質量在此時期幾乎不能被偵測到(圖3B)。此外我們也發現Sp1的總蛋白質量在大鼠神經膠瘤細胞或是人類子宮頸癌組織與彼此的正常細胞或是組織比較都有極為顯著的增加(圖3B和C)。
圖3. (A)在有絲分裂期JNK1會磷酸化Sp1而增加Sp1的穩定性。(B)在神經膠瘤細胞株中在有絲分裂期JNK1被活化而促進Sp1的磷酸化以維持Sp1的量,但是初級神經膠細胞在有絲分裂期則沒有JNK1的活化和Sp1的存在。(C)人類子宮頸癌組織的Sp1蛋白質量是呈現高度比現狀態,反之正常組織呈現高度泛素修飾的不穩定Sp1。

圖4. 在MNU所誘發的乳腺癌發生過程中JNK 的活化和蛋白質量和Sp1的累積是呈現重要的相關性。

先前在動物實驗中已證實一致癌藥物N-甲基-N-亞硝酸尿素(N-methyl-N- nitrosourea, MNU)能夠有效的(>90%)誘發大鼠產生乳腺癌。在我們的實驗中,17隻大鼠在注射MNU後八周有12隻被成功誘發出腫瘤的形成(圖4A),進一步以組織切片染色分析或是西方點墨法我們發現Sp1在MNU誘發的乳腺腫瘤形成過程中與正常組織比較Sp1是有逐漸被大量累積(圖4B和C),此外在MNU誘發的乳腺腫瘤中這JNK1的蛋白質表現量也呈現相對應的增加 (圖4C). 因此經由此實驗也顯示在乳癌發生過程中Sp1量的累積與JNK1的活性增加有呈現一個重要的相關性。

其他的研究已經顯是不正常的Sp1活性可能經由增加其下游一些致癌基因的表現,例如血管生成因子(VEGF),以促進癌細胞的增生和轉移能力,而且Sp1的轉錄活性對於調節細胞增生、血管增生和多種癌症細胞存活相關基因表現也是必須的。在這個研究我們發現Sp1量的增加對於腫瘤的形成可能是重要的,而這Sp1量的累積可能部分是基於JNK1在癌細胞發生過程中量逐漸的增加,進而導致活化態JNK1增加而促進Sp1在有絲分裂期的穩定性以避免經由進行泛素依賴性路徑而被分解。然而在正常細胞這Sp1的蛋白質量有明顯的減少,而且JNK1在有絲分裂期也幾乎呈現不活化態 (圖5).
圖5. 我們找到在腫瘤細胞中在有絲分裂期JNK1的活化是必須的,而且JNK1會促進Sp1的磷酸化而幫助Sp1蛋白質穩定,但是在正常細胞中JNK1的量是低的,而且也不會在有絲分裂期中被活化,因此Sp1在此時是會經由泛素修飾路徑而被分解。
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