第五卷 第二期 - 2008年七月四日
以病毒誘導的基因靜默策略研究蘭花花部功能基因
謝明憲、陳虹樺*

1成功大學生命科學系及2生物科技所
Email: hhchen@mail.ncku.edu.tw

Plant Physiology 143: 558-569 (2007)

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灣的蝴蝶蘭產業,為我國最大宗的外銷花卉,更是政府重點培育的精緻農業之一。台灣有兩種原生蝴蝶蘭:姬蝴蝶蘭為小形花,顏色變化豐富;台灣原生白花蝴蝶蘭(市面上稱台灣阿嬤),其花形優美,是目前花卉市場的主力品種。蝴蝶蘭染色體數目2n=38,且基因體大小約和人類的一樣大,生長週期長,從營養生長到生殖生長階段通常約需2至3年的時間,影響了研究基因功能的進展。因此蘭花功能基因的確認,最大的挑戰為研究生殖階段基因的功能。目前以遺傳學方法進行功能性基因研究可以分為正向遺傳學(forward genetics)及反向遺傳學(reverse genetics)兩種。正向遺傳學是從觀察到表型變化再研究它的基因變化,而反向遺傳學則是從先找到基因再研究它可能造成的表型變化。對於蘭科植物功能性基因的研究,難以使用正向遺傳學策略的原因係由於蘭花世代長及缺乏完整的遺傳圖譜,而使用傳統反向遺傳學策略,如T-DNA insertion或transposon tagging工具,則面臨蘭花基因轉殖效率低及有性繁殖世代長。因此在這種不利的狀況下,蘭花功能性基因研究進展緩慢。所幸,近來新發展出另一項反向遺傳學策略工具,即病毒誘導基因靜默(virus induced gene silencing, VIGS)策略,則不需透過有性繁殖世代及複雜的基因轉殖操作,因此對於花部功能基因的研究是一項極有效率之工具。

病毒誘導基因靜默是一種利用重組病毒表達RNAi的策略,也就是以重組病毒感染殖株後,利用病毒系統表達Hairpin-RNA重組基因序列,啟動RNAi效應。VIGS具有快速、高效率、高專一性的特點,適合作為功能基因體分析之工具。我們首先篩選出可供構築VIGS的蘭花病毒載體。目前成功被構築使用的VIGS的載體病毒,常見的有馬鈴薯X病毒(Potato virus X, PVX)及菸草嵌紋病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)。從病毒分類上已知PVX及喜姆比蘭嵌紋病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)均屬於Potexvirus,而TMV及齒蘭輪斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)則同屬於Tobamovirus。經篩選蘭花病毒所引起的病症及感染能力,最後篩選出以盛行於蘭花的CymMV作為構築VIGS的病毒載體。此載體經由重組插入控制葉綠素合成的Phytoene desaturase (PDS) 基因,再接種於蝴蝶蘭葉片3週後,經由即時定量real time RT-PCR檢測結果,發現PDS基因表達之RNA轉錄體明顯降低約54%,因此確認CymMV病毒載體可應用於蝴蝶蘭功能性基因研究。

此外,為了加速以CymMV構築VIGS的病毒載體在蘭花花部基因之功能性研究,首先依照蘭花栽培業者低溫誘導開花方法,將供試材料置於低溫環境(白天25℃、夜晚20℃)誘導蘭株抽花梗,以維持週年有開花株可供試驗所需。為了測試CymMV載體在所有的花器是否皆能有基因靜默現象,我們選擇一個花部發育基因PeMADS6,為B-class MADS-box基因,利用基因序列近3’端的低保留性但較具高專一性之長約150個核苷酸序列,插入CymMV載體,以體外轉錄法(in vitro transcription)增殖病毒後接種於平均梗長約8公分,具6節花梗之台灣阿嬤抽梗株。經過6週,抽梗株開花後,比較接種病毒空載體(pCymMV-pro60)植株與接種含PeMADS6片段之病毒載體(pCymMV-pro60-PeMADS6IR)的基因靜默植株,經由即時定量real-time PCR檢測分析結果,顯示PeMADS6基因的轉錄分別被減少63±2%、33±3%、23±5%及33±2% 於萼瓣、花瓣,唇辦及蕊柱,證實CymMV載體可抑制PeMADS6基因在蘭花不同花器之表現。

為了進一步確認PeMADS6基因表現量降低,是歸因於VIGS所誘導RNA干擾結果,藉由從接種蘭株抽取及純化的小分子量的siRNA (small interfering RNA),應用Northern blot分析技術,以CymMV Coat protein (CP)基因或PeMADS6基因序列作成探針進行雜合偵測分析載體病毒之CymMV CP基因及PeMADS6基因在表達後mRNA被降解成siRNA的程度。分析結果顯示在接種病毒空載體(pCymMV-pro60)植株與接種含PeMADS6片段之病毒載體(pCymMV-pro60-PeMADS6IR)的基因靜默植株,二者均可被誘導產生21 nts長的CymMV CP siRNA,然而僅有在PeMADS6基因靜默植株可偵測到21 nts長的PeMADS6 siRNA。證實PeMADS6基因的降解產生21 nts長的siRNA產生是具專一性,且藉由以CymMV構築VIGS病毒載體誘導基因靜默策略,可有效降低PeMADS6基因的表現量。此外,在PeMADS6基因靜默植株外表型發生變異,在花器的萼辦、花瓣及唇辦呈現綠化條狀或不規則綠色斑,有些接種試驗植株在花梗上端的花苞呈現前述外表型改變,但花梗下位的花苞則無法綻放,經由解剖觀察發現該花苞在花器的萼辦、花瓣及唇辦也呈現相同綠化的條狀或不規則綠色斑。這些觀察結果,證實降低蝴蝶蘭PeMADS6基因的轉錄量,雖然花苞在分化時的初期發育甚少受到影響,但後期發育則發育受到明顯阻礙。

本研究也在不同品種蝴蝶蘭材料:P. amabilisP. solo Musadium,接種帶有150 nts PeMADS6基因序列之CymMV(pCymMV-pro60-PeMADS6IR)病毒載體,也產生相同的結果。由於該二個品種皆屬四倍體植物,一般的loss-of-function分析是難以在多倍體作物上執行,且若擬研究的基因具有多個拷貝數,用loss-of-function分析方法,如T-DNA insertion或transposon tagging技術,要同時標定具多個拷貝數的重複基因是相當困難。我們的結果顯示應用CymMV病毒載體之VIGS策略則可避開這二種問題,且可在植物體內不同部位,同時降解RNA,而達成同步靜默該基因之表達。

本項研究證實以CymMV所構築的VIGS載體,是非常適合於在蝴蝶蘭分析花部發育基因的功能,且CymMV可廣泛性的感染在蘭科植物內不同屬植物,包含蝴蝶蘭屬 Phalaenopsis、蕙蘭屬 Cymbidium、加德利亞屬 Cattleya、石斛蘭屬 DendrobiumEpidendrumLaeliaLaeliocattleya、文心蘭屬 OncidiumZygopetallum、梵尼蘭屬 Vanilla及萬代蘭屬 Vinda等。因此以CymMV所構築的VIGS載體可應用前述不同屬的蘭花進行功能性基因研究。雖然目前蘭花功能性基因的研究已經有一些進展,但與其他農作物相比,還有距離。隨著花卉產業化步伐的加快,今後蘭花功能性基因方面的研究還需要更加速進行。而以CymMV所構築的VIGS載體將可適用於具大基因體、低基因轉殖效率及繁殖世代長的蘭花,因此對於研究蘭花功能性基因將是最佳選擇的利器。
圖 一、MADS-box g基因靜默植株表型。分別以緩衝液(A 及 D),pCumMV-pro60 (B and E),及pCymMV-CP60-PeMADS6 (C and F)注射台灣阿嬤花梗的開花結果。(C)圖中箭頭表示花瓣中綠化條狀,及(F)圖中箭頭表示唇瓣中綠化條狀。
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