第四卷 第九期 - 2008年六月十三日
MST3激酶經由磷酸化PTP-PEST抑制細胞遷行
賴明德

國立成功大學醫學院生物化學及分子生物研究所
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INHIBITION OF CELL MIGRATION BY AUTOPHOSPHORYLATED MAMMALIAN STERILE 20-LIKE KINASE 3 (MST3) INVOLVES PAXILLIN AND PROTEIN TYROSINE PHOSPHATASE (PTP)-PEST. J. Biol. Chem. 2006, 281:3405-38417

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Ste20激酶群與酵母不育20(ste20)蛋白質有關,是在發芽的酵母費洛蒙反應路成分之一。 Ste20屬於STE激酶群組,是在蛋白激酶的新的分類最新增加的組。 Ste20在酵母訊息聯接的路徑位於有絲分裂原被激活的蛋白激酶(MAPK)最上游。哺乳動物的Ste20家庭結構包括二個子族:P21-被激活的激酶(PAK)和初期中心激酶(GCK)。 PAK經過相互作用調控幾條重要信號路與許多蛋白質包括Rho GTPase。 自我磷酸化在PAK的活化作用扮演一個重要角色。

GCK子族激酶群包括GCK, YSK1和哺乳動物mammalian Ste20(MST) 1-4激酶。 MST1和MST2接受各種細胞凋亡刺激進行自我磷酸化和激活。 MST2在raf-1控制的細胞凋亡(apoptosis)扮演一個重要角色,並且可激活人的大腫瘤遏抑器激酶(Lats1)。 MST1和MST2在傳遞細胞凋亡和生存路徑扮演一個重要角色。 在另一方面,僅有少量報告研究MST3和MST4的生物作用。 MST4通過ERK活化作用在前列腺癌細胞癌化中扮演一個角色。 早期Schinkmann和Blenis使用根據STE20激酶領域的被保存的地區的簡併引子篩選一個Hela細胞cDNA文庫選殖了MST3(哺乳動物Ste20像Ste20絲氨酸或蘇氨酸激酶家庭的激酶3)。

一條2千鹼基 MST3 mRNA由北方點墨分析法顯示在心臟、骨骼肌和胰腺具有最高的水平。 西方點墨分析在多數細胞系皆可偵測了52-kD MST3蛋白質。 MST3 同功型MST3b是使用STE20被保存的催化作用的領域作為探針搜尋EST數據庫尋獲的。 MST3b序列與MST3是相同的但多了在5 端cDNA的末端有一個另外的編碼(coding)區域。 使用反向聚合酶鏈式反應和北方點墨分析得到一條2.5千鹼基MST3b mRNA,其表現限於腦子。相對於普遍存在大多數組織之MST3。過分表現不論原任生型或無活性類型MST3皆無法活化任何已知的MAPK路徑的。 在細胞凋亡期間MST3會產生核遷移和活化作用發生,並且MST3核遷移信號被確認了。 MST3一個獨特的特點是在激酶反應偏好Mn2+作為輔助因素,對絲氨酸或蘇氨酸激酶這是一個異常的特點。我們進一步研究MST3金屬離子輔助因素偏好。 四個金屬離子鎂 (+2), 錳 (+2),鋅(2+)和鈷(2+)在生理濃度範圍之內皆可激活內在,外生和桿狀病毒表達的重組MST3。 相反, 鐵 (+2)和鈣(+2)不功能作為MST3輔助因素。錳(2+), 鈷 (2+)和(鎂2+)活化 - MST3的自我磷酸化主要在蘇氨酸,當鋅(2+)時-被刺激的MST3 自我磷酸化在絲氨酸和蘇氨酸。 由MST3特別自我磷酸化樣式可推論MST3也許根據金屬使用的離子輔助因素的種類施加激酶反應的各種各樣的類型。 据我们所知,這是顯示鋅(2+)作為絲氨酸或蘇氨酸激酶的金屬離子輔助因素的第一個報告。

要了解MST3激酶活動的過程,我們首先研究MST3自我磷酸化 。絲氨酸或蘇氨酸激酶激酶領域可以被細分入次領域。 MST家庭激酶有一個共有序列在次領域七和八, KRNT (V/F) (I/V) GTPFWMAPEVI。 在KRNT蘇氨酸(thr)的自我磷酸化是由二種不同實驗方法証明的。體外由重組MST3可對包含Thr178 (KRNT)的肽進行磷酸化。 此外, 將自我磷酸桿狀病毒表達的重組MST3使用胰蛋白酶處理,再用二維電泳法分析,發現包含KRNT的肽是主要MST3自我磷酸點。 若將KRNT中蘇氨酸改變成丙酸(ala)幾乎完全地去除激酶活性, 顯示自我磷酸為MST3的激酶活性所必需的。 相對將蘇氨酸變化成谷氨酸(glu)可能提高MST3激酶活性。

進一步了解MST3的生物作用,我們利用核糖核酸干擾法壓制MCF-7細胞內在MST3,所建立MST3-RNAi轉染細胞其生長速度是相似於MCF-7。 然而, 利用創傷癒合的分析(wound healing assay) 和Boyden 室分析証實壓制MST3的表現可提高細胞遷移速度。 進一步我們送入抗Rnai之MST3可以逆轉細胞遷移速度,顯示細胞遷移速度的確是因降低MST3 表現所致。 另外,在MDCK細胞大量表現外生MST3則抑制細胞遷移。 相反, 大量表現T178A突變體MST3則進一步提高遷移。 這些數據顯示,內生性MST3可抑制細胞遷行。

下個問題是MST3如何影響細胞遷移? MST3 siRNA並不改變整合蛋白(integrin)表示現。 利用流程cytometry分析激活的整合蛋白也並無重大區別。 相反,在MST3-RNAi轉染細胞中paxillin矽酚基乙氨酸118和31磷酸化刖是顯然的減少的。 在MCF7和MDCK細胞大量表現原型MST3導致paxillin Tyr-31和Tyr-118的酚基乙氨酸磷酸化。在纖連蛋白(fibronectin)培養的細胞MST3存在可能保持paxillin酪氨酸磷酸化,由此抑制細胞伸進和遷移的形成。MST3是一個作用於 Ser或Thr之激酶,所以不可能直接地作用在paxillin 酪氨基酸上。 PTP-PEST去磷酸酶可結合paxillin C終端LIM 3-4領域,並通過酪氨酸31和118磷酸化傳遞信號,且透過N終端LD4主題對paxilliin磷酸化。 PTP-PEST的表現水平、位置或者活化是維護促進控制細胞能動性一個重要管理者,所以我們假設MST3經由 作用PTP-PEST調控paxillin。 要檢驗此一假說,我們探討MST3是否可作用在PTP-PEST或PTP1B。 在體外實驗,重組MST3可磷酸化PTP-PEST,但是無法對PTP-1B磷酸化。 要進一步研究在細胞內MST3可否作用在PTP-PEST, 將PTP-PEST和MST3共同表現在MDCK細胞,然後測量PTP-PEST的酪氨酸去磷酸酶活性。 實驗結果顯示MST3抑制了PTP-PEST的蛋白質酪氨酸去磷酸酶活性並且提高了paxillin磷酸化。 此外, 在MCF7細胞送入MST3 Rnai則可提高PTP-PEST的蛋白質酪氨酸去磷酸酶活性。 我們由此結論, MST3經由自我磷酸化而活化後對酪氨酸去磷酸酶PTP-PEST進行磷酸化並抑制PTP-PEST活性,進而調控paxillin磷酸化,由此抑制細胞伸進及遷移。
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