第三卷 第十期 - 2008年四月十一日
膽紅素模版高分子薄膜之合成以進行 MIP/QCM/FIA 系統對膽紅素之連續偵測
吳岸樺, 許梅娟*

成功大學化工系教授

Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 2345-2353

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紅素是親油且具細胞毒性的澄黃色素,由成熟的紅血球細胞經血紅素代謝而產生。它和白蛋白形成一複合物後被輸送入肝臟,之後以膽紅素尿苷酸形式被排入膽汁。膽紅素能被視為一個判斷肝功能的重要指標且已經被用來驗明一些肝的疾病。膽紅素代謝失調可能造成皮膚或其他組織變黃色,稱高膽紅素血症。高膽紅素濃度甚至可能造成肝臟或膽道功能不正常且也能造成永久性的腦傷害或最嚴重的例子是死亡。在這裡的工作,厚度約 150 奈米的膽紅素模版高分子 (BIP) 膜被塗在一硫醇事先處理過之石英震盪微天平 (QCM) 晶片的金電極上。膽紅素模版高分子薄膜的合成是用 4-乙烯基吡啶 (4-Vpy) 為單體,苯二乙烯 (DVB) 為膠聯劑,及二苯甲酮為起始劑。藉使用光接枝表面聚合的技術伴隨紫外光的照射,一層薄的膽紅素模版高分子膜被製備出來,於是仿生感測器用來感測膽紅素得以發展。這種感測器能夠藉模印位置的特異性鍵結來分辨在溶液中的膽紅素。這種 BIP/QCM 晶片已經重複地超過七個月的被用在許多項連續實驗。BIP 薄膜 /QCM 感測膽紅素的訊號被拿來和非 BIP 薄膜 /QCM 比較。每克的模版高分子可達到吸附 62.0 毫克的膽紅素。模印值是 10.46。一種膽紅素的相似物稱膽綠素者被用來做比較。相似物的比較確認了 BIP 膜對膽紅素的鍵結特異性。選擇性可以達到 31.2 這麼高。待測物溶液的酸鹼值不僅會影響感測的頻率同樣會影響反應時間。偕同適當的溶劑予以洗脫和回收,流動注射分析 (FIA) 可以被應用。結合分子模印和壓電式石英震盪微天平呈現出簡單、特異性、即可重複使用的生物感測系統。這個晶片有絕佳的儲存穩定性且感測單元能被再生供一段很長時間的重複利用。BIP/QCM 晶片的表現是由單一晶片和不同晶片的再現性評估而來且可以達成相當程度的成功。取膽紅素濃度關於頻率位移的線性回歸可以成功的由 BIP/QCM/FIA 系統獲得。由相同 BIP/QCM 晶片量測的在線性被證實。除此之外,重複感測同樣可由不同 BIP/QCM 晶片被證實。總的來說,結合的 BIP 薄膜 /QCM/FIA 方法成功地利用分子模印膜建立感測膽紅素濃度。

功能性單體是 4-乙烯基吡啶 (4-Vpy)。聚合反應的起始劑是二苯甲酮。膠聯劑為苯二乙烯 (DVB)。α 型-膽紅素在這裡的研究用作目標化合物。硫醇化合物,2-丙烯-1-硫醇,被用作金電極表面修飾。QCM 晶片的兩面各披覆一層被濺鍍的金電極。在感測前,QCM 晶片必須被清洗。QCM 晶片被清洗的金電極表面之後以單層 2-丙烯-1-硫醇自組裝修飾。起始作用的二苯甲酮溶液被滴在 2-丙烯-1-硫醇修飾的金電極表面。因此,一薄層的起始劑作為接枝用被組裝在表面。4-Vpy 和 DVB 被加入膽紅素溶液中。上述溶液之後被散佈在已修飾的電極表面。電極晶片被放置入充滿氮氣流的玻璃腔室中。聚合反應之後被紫外光照射所起始。在光接枝表面聚合反應結束後,覆蓋著膽紅素模印聚(4-Vpy-共-DVB) 膜的電極被重複地清洗使殘餘的化學品和模版分子被移除。除了沒有加入膽紅素模版分子外非模印聚 (4-Vpy-共-DVB) 膜以同樣方式製備。4-Vpy 單體、DVB 膠聯劑、二苯甲酮起始劑、和 2-丙烯-1-硫醇的化學結構列於圖 1。概要的表示在 QCM 之金的表面上合成分子模版高分子膜在圖 2 中闡明。
圖 2        化學結構: (a) 4-Vpy 單體; (b) DVB 膠聯劑; (c) 二苯甲酮起始劑; (d) 2-丙烯-1-硫醇
圖 1        概要的表示在 QCM 晶片之金表面上製備分子模版高分子膜


圖 3         組裝 MIP/QCM/FIA 系統

從覆蓋著分子模版高分子薄膜之石英震盪微天平晶片,可藉改變其震盪頻率來偵測膽紅素濃度。樣本被注射進入這樣的系統中。在連續流動狀態下的水被用來帶動注射入的樣本至偵測位置,稱流動注射分析 (FIA)。MIP/QCM/FIA 系統的組裝如圖 3 所示。覆蓋著膽紅素模印高分子薄膜的石英震盪晶片被放在 QCM 裝置裡的支托物。FIA 系統被打開且被使用的同時有連續水流。水流被連續地傳遞進水流道直到達成一穩定的響應頻率。接著,分析物水溶液被注入流動系統中。直到下一個穩定頻率達到為止,改變的頻率一直被紀錄著。每個偵測之後,連續水流被切換成清洗溶劑流經水流道。因此,QCM 晶片在原位置可因此而被重新再生。
圖 4         合成之膽紅素模印高分子膜表面的 SEM 照片 (a) 上視圖; (b) 側視圖

QCM 晶片之金電極表面被 2-丙烯-1-硫醇修飾去增強膽紅素模版高分子膜和金電極表面間的吸附。圖 4(a), 4(b) 分別是覆蓋在金電極上之膽紅素模版高分子膜的 SEM 上視圖和側視圖。
圖 5        樣本和溶劑注射的代表性響應頻率變化曲線
均勻膽紅素模版高分子膜的表面如圖 4(a) 所示。 在圖 4(b) 中,膽紅素模版高分子膜的厚度可由照片之刻度條指出約為 150 奈米。相對平滑的膜表面同樣可在照片中觀察到。

在膽紅素模印高分子膜被製備後,石英震盪微天平系統被用來偵測膜青喜的情形。偵測溶液中膽紅素的濃度於膽紅素模印高分子/石英震盪微天平系統在流動注入迴路中,水當作移動相,連續地傳遞穿過系統中的通道,樣品則被注入系統中樣品的迴路中。圖五為典型的石英震盪微天平之偵測信號 。樣品的注入造成頻率飄移,其為分析物溶液結合在膽紅素模印高分子膜上的結果,在頻率達到穩定的狀態,洗滌液注入流動的系統洗滌被吸附的分析物, 可以從圖中觀察頻率的降低在樣品注入後可恢復到一開始的狀態在洗滌液使用後。
表 1        QCM/FIA 系統之響應時間對酸鹼值

利用石英震盪微天平偵測膽紅素溶液之 pH 值的影響在 pH 範圍由5.4到11.5而且回應時間對 pH 值的相互關係列在表一。當膽紅素溶液而較高的 pH 值時,回應時間會變長。回應時間為分析物和膽紅素模印高分子膜之間相互作用的相互關係,在比較高的 pH 值膽紅素對分子膜印高分子膜有較強的結合強度,因此,需要比較長的時間達到平衡。晶片被更進一步的驗訖來校正膽紅素的濃度,我們可以獲得膽紅素濃度對頻率飄移的線性關係之斜率為23.45(赫茲/毫克/毫升),校準範圍為0.45到11毫克/毫升。由石英震盪微天平偵測膽紅素濃度則有一條校準的膽紅素直線關係,其可以量測分子模板高分子最大的吸附量約為62毫克/克。
圖 7        從BIP/QCM 晶片感測膽紅素和膽綠素比較響應頻率數據圖表。膽紅素平均 RSD 是 32.46%.
圖 6        化學結構: (a) 膽紅素; (b) 膽綠素 及 3D-構型: (c) 膽紅素; (d) 膽綠素


膽紅素模印高分子/石英震盪微天平晶片的選擇性也可被測試,膽綠素,一種膽紅素的相似物用來和膽紅素比較。在圖六中可以看出膽紅素和膽綠素的化學結構和分子量幾乎相同。兩個分子主要的差異在於 C10上,膽紅素為單鍵而膽綠素則為雙建,因此,膽紅素可以形成分子內氫健然而膽綠素則不行。圖七為膽紅素模印分子/石英震盪微天平晶片偵測比較的結果,膽紅素的平均相對平方偏差為32.46%,膽綠素的偵測信號顯示膽紅素模印高分子膜喜愛膽紅素勝過於膽綠素因此在膽紅素模印高分子膜中膽紅素的吸附量遠高於膽綠素,明顯地,圖顯示膽紅素模印高分子有選擇性而且其對膽紅素有特異性的結合,膽紅素模板高分子膜製備在石英震盪微天平的最大選擇性定義為膽紅素的結合量對膽綠色的結合量,其值為31.2。膽紅素模板高分子膜和非模板高分子膜各自地被合成在石英震盪微天平晶片上,圖八為偵測膽紅素從BIP/QCM和non-MIP/QCM晶片的結果。模印高分子膜對膽紅素顯示令人滿意結合效果然而非模印高分子則為較低的交互作用。最大的模印比例,定義為吸附膽紅素的量對吸附膽綠素的量之比值,其值為10.46, 這結果証實了膽紅素模印高分子膜的分子模印效果。
圖 9        從相同 BIP/QCM 晶片所得響應頻率再現性。平均 RSD 是 15.84%.
圖 8        從覆蓋分子模版高分子和非模版高分子膜之 QCM 晶片比較 QCM 偵測頻率。從 MIP/QCM 晶片所得頻率位移之平均 RSD 是 8.16%.


相同的膽紅素模印高分子/石英震盪微天平晶片亦可被用來測試偵測信號的再現性,在每次注入膽紅色而且達到平衡後,膽紅素模印高分子/石英震盪微天平晶片,膽紅素模印高分子/石英震盪微天平晶片會恢復藉著注入溶劑。另外,晶片能夠儲存在去離子水在室溫下且在下依個實驗可再使用, 圖九顯示五次不同批操作的量測,其平均 RSD 為 15.84%。從這些不同批的實驗校正相互關係為一致的,其校準為線性且斜率為 24.14 赫茲/毫克/毫升並有高的相關係數 0.913,因此實驗證明其偵測信號有再現性.。總結這個論文的所有資料,其結果平均斜率為 23.91,平均 RSD 為 0.9%。斜率更進一步証實了量測的再現性其可信度。我們發現膽紅素模印高分子/石英震盪微天平晶片十分穩定不僅在連續流動系統中長週期低操作而且在一次又一次地使用下亦然,這個晶片已經證明它的穩定性在超過七個月下仍不失其敏感度,這是分子模印技術中令人滿意的優點。
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