第二卷 第一期 - 2007年十一月二日
中樞神經系統修復之策略: 干擾前列腺素E2及其受體EP2的作用降低神經膠細胞誘導型一氧化氮合成酶的表現
曾淑芬教授

成功大學生命科學系
stzeng@mail.ncku.edu.tw
Glia. 2007 Jan 15;55(2):214-223

要 -- 中樞神經系統受傷後,神經膠細胞活化並大量表現誘導型一氧化氮合成酶(iNOS) ,產生高量一氧化氮(NO)引發神經細胞的損傷加劇致使中樞神經組織的修復更加困難。已知iNOS的表現是受calcium-independent調控。然而,本文將闡述最近在我們實驗室發現增加iNOS新的調控機制: 模擬中樞神經受傷後的微環境因子前列腺素(prostaglandin E2;PGE2)與前發炎因子腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和干擾素-γ (IFN-γ)共同處理星狀膠細胞 (astroglia),發現PGE2透過活化其受體蛋白EP2藉由胞內環單磷酸腺苷/蛋白質激酶A/鈣離子(cAMP/PKA/calcium)訊息調控路徑提高iNOS的表現量及NO的生成量。我們的發現提供一個重要資訊有助於未來研發中樞神經系統修復有效的策略。

中樞神經系統的細胞包括神經元細胞及神經膠細胞而神經膠細胞包括星狀膠細胞、髓鞘(myelin)的寡樹突膠細胞(oligodendroglia)及具有巨噬細胞特性的微膠細胞(microglia)。其中,星狀膠細胞是組成腦及脊髓的中樞神經系統含量最多的神經膠細胞。在發育個體或健康成體的中樞神經系統內,星狀膠細胞功能包括調控神經元細胞的存活及成熟,神經元細胞代謝及神經傳導物質的恆定,及突觸的可塑性。基於這些生理功能一般認為星狀膠細胞在受傷的中樞神經系統具有保護神經元細胞的能力。然而,在急性或慢性的中樞神經退化疾病中發現星形纖維增生(astrogliosis),此現象是星狀膠細胞受前發炎因子的作用而增生及活化。活化的星狀膠細胞可以釋放大量的前發炎媒介物質參與中樞神經系統受傷後發生的神經發炎(neuroinflammation)反應。不僅,活化的星狀膠細胞表現大量的細胞骨架中間絲蛋白(如膠質纖維酸性蛋白、vimentin、nestin)型態轉為肥大形成膠質疤(glial scar),此物理性屏障雖然阻止發炎反應的擴張,但卻阻礙神經軸突的再生,導致中樞神經系統組織修復的困難度 (圖一)。因此,一般相信抑制星狀膠細胞的活化有助於損傷的中樞神經系統的修復。
圖一. 圖解說明神經膠細胞活化及膠質疤 (glial scar) 在神經退化扮演的角色(modified from Tzeng et al. 2005)


類似微膠細胞的細胞特性,活化的星狀膠細胞經由生物激素(如TNF-α、IFN-γ、IL-1β)的作用激發胞內iNOS的表現進而導致高量NO的產生及釋放 (圖一)。左旋精胺酸(L-arginine) 經由NOS作用氧化產生NO來調控體內許多基本生理功能,例如血管擴張、呼吸及神經傳導等。中樞神經系統神經元細胞及神經膠細胞表現三種NOS,分別是內皮型NOS (endothelial NOS; eNOS) ,神經元型NOS (neural NOS; nNOS)和iNOS,其中iNOS在受傷發炎反應發生時,會被誘導表現。根據許多的研究報告證實,在中樞神經系統受傷後過量的NO會產生,主要是來自於活化的神經膠細胞表現大量的iNOS (Moncada and Bolanos 2006)。已知誘導iNOS的表現是受calcium-independent調控。過量NO會與超氧陰離子(superoxide anion; O2-)反應產生強氧化物質peroxynitrite (ONOO-);已知在人類神經性疾病(如腦中風、創傷性腦損傷、阿滋海默症、帕金森氏症、肌萎縮側索硬化症、脊髓損傷)中,peroxynitrite本身具有很強的細胞毒性,可誘發產生寡樹突膠細胞及神經元細胞的死亡。再者,研究報告指出具有E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase)活性的parkin蛋白經由過量的NO作用後會進行S-亞硝基化(nitrosylation)的反應,其E3泛素連接酶活性受到抑制,而導致帕金森氏症誘發(Chung et al. 2004)。此外,peroxynitrite抑制粒線體複合體 I (complex I) 與細胞色素氧化酵素(cytochrome oxidase)的活性,破壞神經元細胞能量的產生,而引起神經元細胞的死亡(Moncada and Bolanos 2006)。

花生四烯酸( arachidonic acid )及其代謝產物,不但在健康的中樞神經系統負責調控體內重要生理功能,也會調節各種神經退化性疾病發生後的發炎反應 (Tzeng et al. 2005)。前列腺素(prostanoids; PGs) 是花生四烯酸代謝產物群之一,在中樞神經系統含量很高為PGE2,可引起發燒及增加疼痛敏感。前人研究結果顯示,患有阿滋海默症及其他神經性病變的病人的腦脊髓液中檢測到高量的PGE2。 活化的神經膠細胞在受傷的中樞神經系統會釋放大量PGs;先前研究結果證實星狀膠細胞經內毒素脂多醣類(lipopolysaccharide, LPS)的作用會誘導cyclooxygenase 2 (COX2)的表現,進而產生大量的PGE2。另外,ATP 及 phorbol 12-myristate 13-acetate作用在經由細胞激素(cytokines)處理的星狀膠細胞會引起顯著性增加PGE2的釋放。

PGE2作用在細胞膜上多種G蛋白耦合性受體( G protein-coupled receptors),如高親合性E subtype受體 (EP1-4) 及低親合性PG受體(如FP)。星狀膠細胞可表現所有的EP受體 (EP1、EP2、EP3、EP4)及FP,所以PGE2可透過活化其細胞膜受體調控星狀膠細胞的功能。最近與本系麥愛堂教授合作,我們研究發現PGE2藉著其EP2受體引發胞內訊息傳遞路徑,在TNF-α及IFN-γ 的共同作用下會加強星狀膠細胞iNOS的表現量,進而可強化星狀膠細胞的活化(Hsiao et al. 2007)。以下是這篇研究論文的精簡內容。
圖二. 胞內訊息傳遞路徑參與PGE2/EP2增加經TNF-α及IFN-γ處理星狀膠細胞產生的iNOS表現量。 在前發炎因子TNF-α及 IFN-γ共同作用下 PGE2 引發cAMP/PKA 訊息傳遞路徑活化下游p38MAPK及透過活化IP3受體增加內質網釋放Ca2+ 增加胞內Ca2+的量;胞內Ca2+上升可能刺激PKC更帶動胞內Ca2+的提升;另外,PKA可能直接活化。這一連串第訊息傳遞路徑進而活化轉訊因子CREB最後提高細胞激素誘導iNOS在星狀膠細胞的基因轉錄及蛋白表現量 (modified from Hsiao et al. 2007)


1. PGE2透過其EP2受體增加活化星狀膠細胞iNOS的表現量
研究使用的星狀膠細胞是從1-2天大品系是Sprague-Dawley的幼鼠大腦皮質分離出來,並且培養7-8天以上後再進行實驗。單獨處理TNF-α (10 ng/ml)、IFN-γ (10 ng/ml)或PGE2無法誘發星狀膠細胞iNOS的產生;但是,用前兩者共同處理 (以下縮寫為T/I)則會誘發星狀膠細胞表現iNOS。進一步以PGE2 (0.03-30 μM)共同處理會使iNOS蛋白的表現量及NO的產量顯著的上升。接著利用不同的EP受體的促效藥劑(agonist)發現只有EP2促效藥劑 butaprost (100 nM)增加T/I誘導的iNOS表現量。另一方面,再利用RNA干擾技術降低EP2在星狀膠細胞的表現量,可阻斷PGE2增加iNOS 的效果。此研究結果證實PGE2是透過EP2受體增強T/I處理的星狀膠細胞內iNOS的表現。而且,我們也發現PGE2可增加T/I誘導混合神經膠細胞(mixed glia)或微膠細胞的iNOS 的表現量 (圖三)。另外,定量PCR (Q-PCR)分析證明PGE2提高iNOS蛋白量是來自於增加iNOS基因轉錄表現。並且,膠體電泳位移分析(electrophoretic mobility shift assay ; EMSA)實驗進一步確認是經由EP2受體的活化增強iNOS基因啟動子(promoter)的活性,此起動子內含有轉錄調控序列(cAMP-responsive element; CRE)。接著,加入以CRE結合蛋白(CREB)的抗體則抑制此啟動子的活性,說明了EP2可以活化CREB進而提升iNOS基因的轉錄而使蛋白質的表現量增加。
圖三. 給予混合膠細胞(mixed glia)或微膠細胞(microglia)EP2 促效劑butaprost (EP2) 處理增加T/I誘導iNOS的表現量。從1-2天品系Sprague-Dawley幼鼠大腦皮質分離出來的混合膠細胞及微膠細胞以T/I及EP1、EP2、EP3的促效藥處理24小時。控制組(0)為處理T/I不處理EP促效藥的組別。iNOS 蛋白表現量以西方點墨法分析。


2. 阻斷PKA及calcium 訊息傳遞路徑降低活化的星狀膠細胞iNOS的表現量
處理膜通透類似cAMP的分子(dbcAMP)會增加T/I誘導的iNOS表現量。已知EP2是Gs蛋白耦合性受體可活化腺苷酸環化酶(adenylyl cyclase)增加胞內cAMP的含量,藉以活化PKA來調控下游基因的表現。所以,當加入一種PKA抑制劑(KT5720),發現KT5720完全阻斷EP2促效藥劑 butaprost增加iNOS表現量的效果;而且,抑制PKA下游訊息傳遞路徑的分子p38MAPK(SB203580)也可以部份阻斷butaprost的作用。這項實驗顯示EP2活化PKA可誘發下游的p38MAPK的活性來調控iNOS的表現。另一方面,我們利用本校生物科技中心活體單細胞光學影像分析系統,發現PGE2或butaprost能導致T/I處理的星狀膠細胞內鈣離子濃度的上升。加入胞內鈣離子蛪合劑(chelator) BAPAT-AM可以有效阻止鈣離子濃度的上升,但是加入胞外鈣離子蛪合劑EGTA並沒有此效果。以上實驗結果證明此種鈣離子濃度的上升是來自於胞器內(例如內質網)鈣離子的釋放。KT5720、staurosporine (PKC抑制劑)及2-APB(釋放內質網鈣離子到細胞質的IP3受體的阻斷劑)可以有效抑制butaprost所引發的鈣離子濃度的上升。以上實驗結果指示EP2活化PKA誘發的下游分子除了p38MAPK也包含IP3及PKC (詳細請見圖二)。並且,前述的藥劑(BAPAT-AM、KT5720、staurosporine、2-APB)有效阻止了EP2促效藥劑 butaprost增加的iNOS表現量。總言之,我們的實驗結果首度提出一個新穎的調控機制: PGE2/EP2可藉由活化PKA引發胞內鈣離子訊息傳遞來參與提升細胞激素誘發的iNOS的表現。

3. 結語
我們的研究結果說明PGE2活化其受體蛋白EP2進而引發細胞激素處理的星狀膠細胞cAMP/PKA/p38MAPK及cAMP/PKA/calcium訊息傳遞,增加其iNOS基因轉錄及蛋白的表現量。並且闡明PGE2/EP2可能參與中樞神經系統受傷後細胞激素誘導星狀膠細胞活化的現象。因此,用RNA干擾技術或是抑制胞內訊息傳遞路徑來阻斷EP2的作用可以研發作為未來中樞神經系統受到損傷後一個有效的治療策略。


參考文獻
Chung KK, Thomas B, Li X, Pletnikova O, Troncoso JC, Marsh L, Dawson VL, Dawson TM. 2004. S-nitrosylation of parkin regulates ubiquitination and compromises parkin's protective function. Science 304(5675):1328-31.
Hsiao HY, Mak OT, Yang CS, Liu YP, Fang KM, Tzeng SF. 2007. TNF-alpha/IFN-gamma-induced iNOS expression increased by prostaglandin E2 in rat primary astrocytes via EP2-evoked cAMP/PKA and intracellular calcium signaling. Glia 55(2):214-23.
Moncada S, Bolanos JP. 2006. Nitric oxide, cell bioenergetics and neurodegeneration. J Neurochem 97(6):1676-89.
Tzeng SF, Hsiao HY, Mak OT. 2005. Prostaglandins and cyclooxygenases in glial cells during brain inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(3):335-40.

< 上一篇下一篇 >