第一卷 第五期 - 2007年 九月 二十一日
整合型反轉錄聚合酶連鎖反應晶片應用於快速病毒檢測
連剛逸1, 李婉綺2, 黎煥耀3, 李國賓1,2
  • 國立成功大學 奈米科技暨微機電系統工程研究所
  • 國立成功大學 微生物學科暨微生物及免疫學研究所
  • 國立成功大學 工程科學系所
*E-mail: gwobin@mail.ncku.edu.tw
Paper published in Biosensors and Bioelectronics, vol. 22, pp. 1739-1748, 2007.
圖一
年來,生物臨床檢體之前處理與濃縮萃取之程序於醫學檢驗中扮演著十分重要的角色。於傳統醫學檢測中,臨床檢體之前處理往往浪費許多的時間,且其繁複的人工操作與步驟更容易增加檢體之浪費與檢測之準確性。因此,隨著微機電製程技術之成熟,已在許多不同的領域中有顯著的發展,尤其在微小化快速生醫檢測分析晶片更扮演了十分重要的推手角色。藉由微機電製程技術所生產之微流體生醫檢測晶片,其具有高檢測效能、可拋棄式、可攜帶性、低樣品及檢體消耗量、低耗能、體積小以及成本低等優點。尤其以整合全程微流體系統包含生物樣品前處理、傳輸及偵測於同一晶片上之設計,最具發展潛力以及市場價值。本研究提出一個利用微機電製程,以免疫學之原理利用微型磁珠(Magnetic bead)結合專一性極高之抗體,以萃取特定之RNA病毒(RNA-based viruses),並將以濃縮、純化、分離後,全自動進行反轉錄聚合酶連鎖反應之生物晶片系統。此整合型晶片之操作原理如圖一所示。首先,將具有極高專一性之抗體附著於超順磁性之微型磁珠表面 (Fig. 1a),再將此鍵結高專一性及高靈敏性之抗體的磁珠(Antibody-conjugated magnetic bead),利用微流體模組傳輸運進入反應區與生物檢體進行混合反應 (Fig. 1b)。由流體傳送時所造成之流體擾動,將使目標之病毒黏附於磁珠表面之高專一性的抗體上 (Fig. 1c)。其後,為了去除存在於生物培養液中會影響RNA增幅反應的不穩定物質,將晶片上之微型線圈所組成之磁分離器提供以特定之電流,以產生微型磁場將磁珠吸附在晶片表面 (Fig. 1d),並在流體之樣品中分離其他不穩定物質以達目標檢體的純化及濃縮 (Fig. 1e),藉由此步驟,檢體將被淨化且集中,再透過晶片上之微型溫度控制模組控制反應槽內溫度高低之循環,進行細胞裂解以及反轉錄聚合酶連鎖反應將目標病毒進行檢測 (Fig. 1f-1g)。

聚合酶連鎖反應(Polymerase chain re-action, PCR)是一套發展完善且簡便有效的核酸增幅方法,它可使DNA在短暫的時間中增幅。其原理主要為在要增幅的DNA片段兩端分別設計一個前置引子(forward primer)和反置引子(reverse primer),使之與已變性的單股目標DNA緩冷配對(annealing)後,再利用DNA聚合酶(DNA polymerase)以目標DNA的兩股分別做為模板(template)來合成新的DNA片段。PCR操作過程主要分成三大部份:(1)以高溫(90°C-95°C)使雙股模板DNA分離,(2)使引子與單股模板DNA做緩冷配對(50°C-65°C),(3)再將溫度調整到DNA聚合酶作用的有效溫度而合成新的DNA股(70°C-75°C)。藉由循環式的溫度升降操作下,每一次熱循環可使DNA的量加倍,若重複操作多次,以數學公式計算,DNA增加的量將會是2n,n是代表重複操作的次數。在理想的聚合酶連鎖反應條件下,DNA是以幾何級數增加。而反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcrip-tion-PCR, RT-PCR),是聚合酶鏈式反應的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中,一條RNA鏈被反轉錄成爲互補式DNA(cDNA),再以此爲模板進行PCR反應使DNA擴增。其中,由一條RNA單鏈轉錄爲互補式DNA稱作「反轉錄」,並由依賴RNA的DNA反轉錄酶來完成。隨後,DNA的另一條鏈通過去氧核苷酸引子和依賴DNA的DNA聚合酶完成,隨每個循環倍增,即通常的PCR。RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術,可以檢測很低濃度的RNA。

圖示二
為了實行上述的整合型微流體晶片系統,本微型化晶片主要由三大模組組成,分別為一生物樣品純化模組、一微流體控制模組以及一微溫度控制模組,如圖二所示。生物樣品純化模組主要是由一微型化線圈所組成,主要是用以產生微型磁場以吸附微型磁珠於反應槽中,以達到病毒檢體之萃取與收集。而微流體控制模組由一新型之蠕動式微型幫浦、微型閥門與微流體管道所組成。主要是用於流體傳輸、樣品混合以及生物鍵結反應。此創新微型蠕動式幫浦則是由高分子材料二具甲基矽氧烷(PDMS)之薄膜所組成。藉由單一電磁閥的控制之下,當壓縮空氣進入由PDMS薄膜所組成的氣室時,依序地將薄膜下壓微流體管道造成蠕動式的運動,因此可以將管道中之微流體進行驅動。而微溫度控制模組則是由兩組微型加熱器、一組溫度感測器以及一組溫度電路控制器所組成。藉由溫度感測器回傳之訊號,電路控制器可以精準地自動進行溫度的控制,以進行細胞裂解以及反轉錄聚合酶連鎖反應。此微流體整合型系統藉由主動式微幫浦與微閥門的幫助下,除了能全自動地進行生物樣品前處理以及病毒檢測之外,並可大幅的縮短檢測流程之時間及提高其效率。

圖示三
由實驗資料顯示,本晶片系統已於臨床檢體中成功的純化及檢測出國內流行之登革熱血清第二型病毒(Dengue virus serotype 2)以及腸病毒71型(Enterovirus 71)。如圖三所示,首先將混有登革熱以及腸病毒之生物臨床檢體放入本晶片系統中,經過樣品前處理以及生物反應後所呈現之結果。其中,lane 1以及lane 2為利用鍵結有登革熱抗體的磁珠進行純化,並分別用登革熱專一以及腸病毒專一性的引子進行反轉錄聚合酶連鎖反應的結果;而lane 3以及lane 4為利用鍵結有腸病毒抗體的磁珠進行純化,並分別用登革熱專一以及腸病毒專一性的引子進行反轉錄聚合酶連鎖反應的結果。由結果顯示,鍵結有登革熱抗體的磁珠只會針對登革熱病毒進行純化並檢測出來,相對的鍵結有腸病毒抗體的磁珠也只會針對腸病毒進行純化並檢測。,顯示出本晶片系統的高專一性。此外,利用本晶片之快速升降溫速率之優點,相對於傳統大型儀器檢測,可以節省近50%的檢測時間。相信於不久的將來,本晶片系統所提供之快速自動化檢測平台,將於基因分析、分子生物以及快速感染性疾病之偵測將有極大之助益。
< 上一篇下一篇 >